武海麗，單樹(shù)花，袁琳潔，劉慶午，趙文彬，李卓玉*

1山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

結(jié)腸癌是世界第三大常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其死亡率僅次于肺癌和肝癌［1，2］。由于腫瘤的化療方法產(chǎn)生明顯的毒副作用，因此，尋找天然抗腫瘤藥物成為人類向重大疾病作斗爭(zhēng)的重要手段。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從天然產(chǎn)物中分離出多種抗腫瘤活性物質(zhì)，如黃酮、生物堿等［3］，但關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品廢棄物抗腫瘤活性物質(zhì)的研究報(bào)道較少。

玉米芯是玉米果穗脫去籽粒的穗軸，占玉米棒重量的20% ～30%。我國(guó)年產(chǎn)玉米約15億噸，相應(yīng)玉米芯的產(chǎn)量估計(jì)在4000萬(wàn)噸左右，除了少量用作糠醛、木糖醇等產(chǎn)品的原料外，很大一部分被作為農(nóng)業(yè)廢棄物直接焚燒處理，這不僅造成資源的極大浪費(fèi)，同時(shí)也造成了環(huán)境污染［4］。資料顯示，玉米芯纖維成分具有調(diào)整腸胃，通秘防癌，降低膽固醇，控制肥胖，消除外源有害物質(zhì)汞、砷、鎘等功能，因此，玉米芯作為一種來(lái)源豐富、易于收集、價(jià)格低廉的農(nóng)業(yè)廢棄物，具有廣闊的研究與開(kāi)發(fā)前景［4］。

本實(shí)驗(yàn)主要以玉米芯作為研究對(duì)象，采用生物學(xué)化學(xué)方法獲得玉米芯水提物;用細(xì)胞生物學(xué)方法檢測(cè)玉米芯水提物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響;采用DAPI染色法探討玉米芯水提物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;研究玉米芯水提物的抗癌活性及其機(jī)制，為玉米農(nóng)副產(chǎn)品抗腫瘤活性物質(zhì)的深度開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯(Zea mays)，購(gòu)自山西省太原市天下谷有限公司;結(jié)腸癌細(xì)胞株:DLD1、SW480、SW620，正常細(xì)胞株:HL-7702，由本實(shí)驗(yàn)室保存;改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、無(wú)支原體胎牛血清、胰蛋白酶(Thermo Scientific Hyclone);MTT(北京索萊寶科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO);DAPI;青鏈霉素(100X);NaCL、KCL、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Trition X-100、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D-37520 型離心機(jī)(Biofuge stratos，Germany);FV10000熒光顯微鏡(Olympus，Japan);CL410型-80℃冰箱(Hetofrig);153型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heto-HoltenA/S，Denmark);SPT 倒置顯微鏡(Olympus，Japan);恒溫水浴鍋(Ploystat CCI，Germany);超凈工作臺(tái)(SW-CJ，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);YDS-120-216型液氮儲(chǔ)存罐;酶標(biāo)儀(Biorad Model 550);MP511型精密PH儀;570 nm濾光片;細(xì)胞培養(yǎng)96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)六孔板，封口膜，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，磁力攪拌器，無(wú)菌過(guò)濾器，冷凝管。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取物的制備［5］

將15 g材料分別經(jīng)10倍量蒸餾水加熱回流提取3次，合并3次濾液;用高速冷凍離心機(jī)在4℃下，5000 rpm離心10 min，取上清用布什漏斗過(guò)濾，將所得濾液水浴蒸干，濃縮成浸膏狀;用分析天平稱量，計(jì)算得率，再將浸膏制成100 mg/mL備用。采用75%乙醇提取，即得各材料的醇提物，計(jì)算醇溶浸膏得率，并制成100 mg/mL備用。得率(%)=提取物重量(g)/原材料重量(g)×100%

1.3.2 玉米芯水提液的組分分析

參考Bradford的方法［6］，用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度的系列，考馬斯亮藍(lán)G250顯色，5～15 min內(nèi)在分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處的吸光值，取3次重復(fù)平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再用相同方法處理測(cè)定樣品的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。參照李玲等人方法［7］，采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定多糖含量，。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系 DLD1、SW480、SW620、人肝細(xì)胞HL-7702培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中。

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 DLD1、SW480、SW620、HL-7702細(xì)胞，按常規(guī)細(xì)胞傳代的方法將細(xì)胞制成懸浮液，取100 μL滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，于倒置顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37℃培養(yǎng)箱孵育24 h 后，加入不同濃度(1、2、4、6 mg/mL)的提取物20 μL，每樣設(shè)五個(gè)復(fù)孔，并用不加藥的培養(yǎng)基作為對(duì)照。待藥物作用24 h后吸棄孔內(nèi)液體，用PBS洗兩次加入新鮮培養(yǎng)基，防止藥物顏色干擾結(jié)果，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收值(A值)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算公式如下:

1.3.5 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/mL，接種到6孔板(內(nèi)放置蓋玻片)中，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁后，加入2 mg/mL的玉米芯水提物200 μL，并用不加藥的培養(yǎng)基作為對(duì)照，處理24 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，用-20℃預(yù)冷的4%的多聚甲醛固定30 min，加100 μL 0.3%Triton-X-100 清洗液室溫通透細(xì)胞10 min，最后加DAPI染色液100 μL，室溫避光染色15 min，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果中的數(shù)據(jù)表達(dá)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，數(shù)據(jù)圖中用誤差棒(Error Bar)表示標(biāo)準(zhǔn)差，單因素分析采用Student’s t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯水提取、醇提取液得率

稱取玉米芯原材料15 g進(jìn)行水提和醇提，將提取液濃縮蒸干稱干重，計(jì)算得率。結(jié)果表明，玉米芯采用不同溶劑提取所得的提取液得率差別較大，水提物得率約為6%，而醇提物得率約為2%左右，說(shuō)明玉米芯的水溶成分多于醇溶成分。

2.2 玉米芯水提液的組分分析

資料顯示，玉米芯主要是由半纖維素、纖維素組成。由此推測(cè)玉米芯水提取物的有效成分為多糖。因此，分別采用Bradford法和3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定了玉米芯水提液中蛋白及多糖的含量。結(jié)果表明，玉米芯水提液中蛋白濃度為0.145 mg/mL，糖含量為23.2 mg/mL。結(jié)果表明，玉米芯水提液的主要成分為多糖，該多糖類物質(zhì)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有特異殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞作用不明顯。

2.3 玉米芯提取物對(duì)DLD1細(xì)胞增殖活力的影響

采用MTT法比較玉米芯水提取物和醇提取物對(duì)DLD1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，玉米芯水提物對(duì)腸癌細(xì)胞DLD1生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而其醇提物對(duì)DLD1細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制(如圖2)。

圖1 玉米芯提取物對(duì)DLD1細(xì)胞增殖活力的影響Fig.1 The influence of corncob extraction on DLD1 proliferation

2.4 不同濃度的玉米芯水提物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1、SW480、SW620 增殖活力的抑制

為了比較玉米芯水提物對(duì)腸癌細(xì)胞株DLD1、SW480、SW620和正常細(xì)胞HL-7702細(xì)胞增殖活力的影響，采用MTT法測(cè)定不同濃度玉米芯水提物對(duì)各細(xì)胞增殖能力的影響。數(shù)據(jù)顯示，各濃度的玉米芯提取物對(duì)這幾種腸癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用。其中，低劑量組(1 mg/mL)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率較低，隨著藥物濃度的增加，增殖抑制率也增加，且呈明顯的量效依賴關(guān)系(如圖3A)。玉米芯水提物對(duì)不同的結(jié)腸癌細(xì)胞株抑制能力不同，其中對(duì)SW480細(xì)胞抑制能力最強(qiáng)，SW620細(xì)胞次之，對(duì)DLD1細(xì)胞抑制能力最弱，在作用24 h后，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為2、3、4 mg/mL。玉米芯水提物在低濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞HL-7702沒(méi)有抑制作用，高濃度時(shí)略有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度為6 mg/mL(如圖3B)。

2.5 玉米芯水提物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖2 玉米芯水提物對(duì)不同細(xì)胞增殖抑制能力的比較Fig.2 Comparison of cell proliferation inhibition effect of corncob on different cells

為觀察玉米芯水提物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，在倒置顯微鏡下觀察了經(jīng)過(guò)該水提物處理后的細(xì)胞形態(tài)，用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的變化(用359 nm激發(fā)光)，結(jié)果如圖4-A，B所示;觀察多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞系的凋亡率(如圖4-C)。

圖3 玉米芯水提物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effects of aqueous extract of corncob on apoptosis

體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)一定濃度的玉米芯水提物作用24 h后，在倒置顯微鏡下觀察(如圖4A)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，細(xì)胞變圓，細(xì)胞體積也有所變小，貼壁細(xì)胞明顯減少，由貼壁而脫落懸浮于培養(yǎng)液中;而對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)均勻，伸展性好，生長(zhǎng)良好。正常細(xì)胞HL-7702在藥物處理前后細(xì)胞核形態(tài)變化不是很明顯。

玉米芯水提物處理24 h后的各腸癌細(xì)胞株經(jīng)DAPI染色后，置于熒光顯微鏡下用359 nm激發(fā)光觀察細(xì)胞核的變化，結(jié)果見(jiàn)圖4B。由圖可知，各細(xì)胞株的對(duì)照組細(xì)胞核均為完整的圓形，發(fā)出均勻明亮的熒光，未發(fā)生染色質(zhì)濃縮。當(dāng)用藥物處理結(jié)腸癌細(xì)胞24 h后，大部分細(xì)胞發(fā)生了凋亡，在SW480中尤為明顯。視野中可以看到許多細(xì)胞核發(fā)出的亮藍(lán)色熒光表現(xiàn)出染色質(zhì)的不均一化，且細(xì)胞核形態(tài)呈現(xiàn)固縮、不規(guī)則、邊集、分裂，有的出現(xiàn)典型的“梅花”狀的凋亡小體。正常細(xì)胞7702則在處理前后細(xì)胞核無(wú)明顯變化。在玉米芯水提物處理后，腸癌細(xì)胞系 SW480、SW620、DLD1的凋亡率分別為39.67%、28.33%、12.33%，而正常細(xì)胞 HL-7702 的凋亡率僅為6.83%。

3 討論

目前研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞增殖的失控可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，細(xì)胞的過(guò)度增殖是細(xì)胞惡變的潛能，也是腫瘤發(fā)生及惡化的主要原因［8］。根據(jù)1981～2006年間對(duì)北美、歐洲、日本抗癌藥物市場(chǎng)的分析，就155種臨床應(yīng)用的抗癌藥物數(shù)據(jù)分析顯示:47.1%源于未經(jīng)修飾的天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的衍生物，或是以天然產(chǎn)物復(fù)合物藥效基團(tuán)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成的藥物［9］。因而，從自然界中尋找發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗癌活性成分或先導(dǎo)化合物一直是國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)家非常關(guān)注的課題和研究的熱點(diǎn)［10］。

本文探討了玉米芯水提物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、DLD1的增殖作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)，玉米芯水提物對(duì)腸癌細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，對(duì)這幾種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率也增加，呈明顯的量效依賴關(guān)系。玉米芯水提物對(duì)不同的結(jié)腸癌細(xì)胞株抑制能力不同，其中對(duì)SW480細(xì)胞抑制能力最強(qiáng)，SW620細(xì)胞次之，對(duì)DLD1細(xì)胞抑制能力較弱。倒置顯微鏡觀察表明，經(jīng)該水提物處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞，形態(tài)發(fā)生明顯的改變，貼壁細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變圓，大面積脫落。DAPI染色結(jié)果顯示:細(xì)胞核呈“月缺形”，且許多細(xì)胞核發(fā)出的亮藍(lán)色熒光表現(xiàn)出染色質(zhì)的不均一化，出現(xiàn)典型的“梅花”狀的凋亡小體。接下來(lái)我們將進(jìn)一步對(duì)玉米芯水提物的有效成分進(jìn)行提取和分離鑒定，確定凋亡途徑及其作用靶標(biāo)，并系統(tǒng)研究其在動(dòng)物體內(nèi)的作用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡普遍存在于腫瘤組織細(xì)胞中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有著密切的關(guān)系［11］。大多數(shù)抗腫瘤藥物能夠誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其抗腫瘤效果與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的活性有關(guān)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的一個(gè)新熱點(diǎn)，也是評(píng)價(jià)療效的一項(xiàng)重要指標(biāo)［12］。DAPI作為特異性的熒光探針已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，DAPI熒光染料可與細(xì)胞核內(nèi)的DNA發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)紫外光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核會(huì)發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，以此觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化情況。早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮，染色加深，或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊;晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜所包繞，即凋亡小體。

玉米芯主要是由35% ～40%的半纖維素、32%～36%的纖維素、17% ～20%的木質(zhì)素及12% ～18%的灰分構(gòu)成［4］。我們分別測(cè)定了玉米芯水提液中蛋白及多糖的含量，結(jié)果表明蛋白濃度為0.145 mg/mL，糖含量為23.2 mg/mL。因此推測(cè)玉米芯水提取物的有效成份為多糖類。已有的研究報(bào)道表明，多糖類物質(zhì)常具有抗腫瘤活性，它們的抗腫瘤機(jī)制主要是通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞周期及腫瘤相關(guān)基因表達(dá)等［13］，而玉米芯水提物及其多糖是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤活性，有效的抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步研究。

植物提取物被用來(lái)治療人類疾病已有幾千年，近年來(lái)，許多具有抗氧化性和抗惡性細(xì)胞增殖作用的多糖類，如海藻中的硫酸多糖，殼聚糖等均得到分離純化。這些糖類均有較高的水溶性，且毒性較低，許多已經(jīng)作為安全的食品制品。因此，將具有抗氧化性和/或抗惡性細(xì)胞增殖作用的多糖類開(kāi)發(fā)作為新型的食品添加劑或者抗腫瘤保健品具有深遠(yuǎn)的意義［14，15］。

1 Nagel J，Brinkoetter M，Magkos F，et al.Dietary walnuts inhibit colorectal cancer growth in mice by suppressing angiogenesis.Nutrition，2012，28:67-75.

2 Meng W，Cai SR，Zhou L，et al.Performance value of high risk factors in colorectal cancer screening in China.World J Gastroenterol，2009，15:6111-6116.

3 Xu SF(徐淑芬).Talking about the comprehensive utilization of corncob.Sci-Tech Infor Dev Econ(科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì))，2011，21:174-175.

4 Wang GB(王關(guān)斌)，Zhao GH(趙光輝)，Li JP(李俊平).Study on the comprehensive application of corncob.Food Med(食品與藥品)，2006，8:55-57.

5 Cui BK，Liu S，Lin XJ，et al.Effects of Lycium Barbarum aqueous and ethanol extracts on high-fat-diet induced oxidative stress in rat liver tissue.Molecules，2011，16:9116-9128.

6 Li GJ(李冠軍)，F(xiàn)u FL(付鳳玲).Two dimensional electrophoresis and extraction of total protein of maize.Sci Corn(玉米科學(xué))，2006，14:100-103.

7 Li L(李玲)，Liu LM(劉立明)，Xie XF(謝曉芬)，et al.3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蘆薈中多糖含量.Instru Anal Monitor(儀器儀表與分析監(jiān)測(cè))，2002，4:30-31.

8 Luo JS(羅俊生)，Zhang Q(張齊)，Guan N(關(guān)寧)，et al.Effection of ginsenoside on Malignant Glioma cell BT325 proliferation.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志)，2006，33:1319-1321.

9 Li P，Chai HY，Kinghorn D.The continuing search for antitumor agents from higher plants.Phytochemistry Lett，2010，3:1-8.

10 Saklani A，Kutty KS.Plant-derived Compounds in Clinical Trials.Drug Discory Today，2008，13:161-171.

11 Melet A，Song K，Bucur O，et al.Apoptotic pathways in tumor progression and therapy.Adv Exp Med Biol，2008，615:47-79.

12 Tan TT，White E.Therapeutic targeting of death pathwaysin cancer:mechanisms for activating cell death in cancer cells.Adv Exp Med Biol，2008，615:81-104.

13 Gao W(高巍)，Hu RJ(胡人杰).The non-immune mechanism of anti-tumor effect of polysaccharide.Tianjin Pharm(天津藥學(xué))，2005，17(5):42-45.

14 Camara R，Costa L，F(xiàn)idelis GP.Heterofucans from the brown seaweed Canistrocarpus cervicornis with anticoagulant and antioxidant activities.Mar Drugs，2011，9:124-138.

15 Costa LS，F(xiàn)idelis GP，Cordeiro SL，et al.Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds.Biomed Pharmacother，2010，64，21-28.