江雪豐 周希瑗

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一, 是導(dǎo)致雙眼不可逆性盲的重要原因, 其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜, 受多種血管刺激因子和抑制因子調(diào)控。其中血小板反應(yīng)蛋白-1 (thrombospondin-l , TSP-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的作用較強(qiáng)的眼部新生血管抑制因子和促進(jìn)因子。作者用免疫組織化學(xué)方法檢測TSP-1 和VEGF蛋白質(zhì)在大鼠模型中的表達(dá)及變化, 以希望對早期DR的發(fā)病機(jī)制有進(jìn)一步的了解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)用封閉群雄性Wistar大鼠40只, 體質(zhì)量200～260 g, 將鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ;Sigma公司)按60mg·kg-1腹腔內(nèi)注射, 注射后48 h檢測尿糖和血糖。血糖濃度達(dá)16.65 mmol·L-1, 尿糖達(dá)+++以上為模型建立成功。成模后每月檢測一次鼠尾血糖。實(shí)驗(yàn)組10只,另取正常對照組10只。正常組大鼠腹腔注射0.1mol·L-1檸檬酸緩沖液。

1.2 眼球標(biāo)本的取材和制片 各組大鼠3個月時以10%水合氯醛腹腔麻醉。麻醉成功后灌注多聚甲醛約300 ml。摘除眼球, 浸泡固定24 h。常規(guī)浸蠟, 包埋, 備用。將制好的眼球標(biāo)本切片, 用于免疫組織化學(xué)染色。

1.3 各組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1和VEGF表達(dá)的檢測 采用免疫組織化學(xué)SP-9002法, 小鼠抗大鼠TSP-1單克隆抗體購自美國NeoMarkers公司, VEGF單克隆抗體、SP-9002免疫組織化學(xué)試劑盒及顯色試劑盒購于中山生物工程有限公司。操作步驟為：切片脫蠟至水；體積分?jǐn)?shù)3%H2O2滴加切片上,室溫孵育15 min；微波修復(fù)抗原15 min, 滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原15 min；滴加TSP-1一抗(稀釋度為1：100)或VEGF一抗(稀釋度為1：300), 4℃過夜；生物素化二抗工作液15 min;辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液15 min,DAB顯色, 復(fù)染, 脫水, 透明, 封固鏡檢。陰性對照實(shí)驗(yàn)以磷酸緩沖液代替一抗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)測定視網(wǎng)膜TSP-1和VEGF的積分光密度,數(shù)據(jù)以x-±s表示, 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn), 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TSP-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 光鏡觀察正常組中TSP-1蛋白質(zhì)的陽性反應(yīng)表達(dá)分布于視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層, 呈深棕黃色；糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)較正常組顯著降低, 尤其在內(nèi)叢狀層、外叢狀層呈極微弱的陽性表達(dá)見表1。

2.2 各組VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 光鏡觀察 正常組大鼠VEGF陽性反應(yīng)在視網(wǎng)膜分布于內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層,胞漿呈棕黃色, 胞核未顯色。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)分布于內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層, 表達(dá)增強(qiáng), 胞漿呈深棕黃色, 內(nèi)核層陽性反應(yīng)細(xì)胞增多, 見表1。

表1 TSP-1和VEGF積分光密度在各組視網(wǎng)膜中的數(shù)據(jù)分析

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是常見致盲性疾病, 基本病理過程表現(xiàn)為微循環(huán)障礙, 主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜血管滲透性增加, 從而促進(jìn)視網(wǎng)膜缺血缺氧及新生血管形成, 最終導(dǎo)致視功能損害［1］。近年來的研究表明, 其中血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是重要的眼部新生血管抑制因子和促進(jìn)因子, 它們在眼底新生血管生成過程中起著重要作用［2］。TSP-1是可由多種細(xì)胞分泌的抗新生血管因子,是一種重要的多肽類內(nèi)源性血管新生抑制物［3］。TSP-l還可與細(xì)胞表面受體、蛋白酶、及細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用, 可刺激細(xì)胞增生, 并參與胚胎發(fā)育、組織分化、細(xì)胞遷移、血管生成、炎癥以及凝血與纖溶等病理生理過程, 其已被公認(rèn)為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子, 它可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,這種抑制作用可被抗TSP-1的單克隆抗體所中和, 并在氧誘導(dǎo)的缺血性視網(wǎng)膜病變過程中起關(guān)鍵作用, 視網(wǎng)膜前新生血管減弱與TSP-1的表達(dá)增加有關(guān)［4］, 研究發(fā)現(xiàn)在老年性黃斑病變中Bruch's膜和脈絡(luò)膜中TSP-1的降低可能會促使CNV的形成［5］。VEGF作為一種強(qiáng)烈的血管通透性因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞分有絲裂原, 在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)TSP-1蛋白質(zhì)在正常組大鼠視網(wǎng)膜中內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層有表達(dá), 呈深棕黃色強(qiáng)陽性反應(yīng)。在糖尿病組TSP-1表達(dá)量減少, 內(nèi)、外叢狀層只見極微弱的表達(dá), 說明在DR早期視網(wǎng)膜缺血缺氧下調(diào)了TSP-1的表達(dá)。研究結(jié)果還顯示, 正常組VEGF有少量表達(dá),在糖尿病組中VEGF表達(dá)呈升高, 結(jié)果與TSP-1表達(dá)相反。DR在高糖狀態(tài)下, 視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙引起的組織缺血缺氧下調(diào)TSP-1的表達(dá), 致使TSP-1不能有效拮抗VEGF的作用, 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖, 增加血管通透性進(jìn)而誘發(fā)新生血管的生成。因此TSP-1與VEGF在早期DR過程中都有表達(dá)且呈動態(tài)過程,它們的表達(dá)失衡在DR早期過程中可能起重要調(diào)控作用, 二者具體調(diào)控機(jī)制及相互作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

［1］Armulik A, Abramssion A, Betsholtz C.Endothlial/pericyte interaction.Circ Res, 2005, 97(6):512-523.

［2］郝勝利, 徐延山, 袁佳琴.糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物治療．國際眼科縱覽, 2006:30(1):58-62.

［3］Hiacott P, Paraoan L, Choudhary A, etal.Thrombospondin 1,thrombospondin2 and the eye.Prog Retin Eye Res, 2006, 25(1):1-18.

［4］Wu Z, Wang S, Sorenson CM, et al．Attenuation of retinal vascular development and neovascularization in transgenic mice over-expressing thrombospondin-I in the lens.Dev Den, 2006,235(7):1908-1920.

［5］Uno K, Bhutto IA, McLeod DS, et al, Impaired expression of thwmbospondin-1 in eyes with age related macular degeneration.Br J Ophthalmol, 2006,90(1):48-54

［6］Takagi H, Oh H, Otani A, et al.Molecular mechanisms of retinal neovascularization in diabetic retinopathy.International Congress series, 2004, 1262:160-163.