陳海南 董啟榕 楊侃 姜偉

骨關節(jié)炎(OA)是一種慢性、漸進性、退行性關節(jié)病變。表現為關節(jié)軟骨細胞外基質(ECM)合成與降解失衡從而造成軟骨變性破壞，最后引起各種臨床癥狀［1］。近年來對其研究已從不同方面展開，而關節(jié)軟骨及軟骨下骨的生化改變也逐漸成為熱點［2］。本研究通過建立兔骨關節(jié)炎(OA)早期模型，檢測關節(jié)軟骨退變過程中MMP-13的蛋白表達，軟骨下骨組織蛋白酶K(CK)、MMP-9的變化規(guī)律，同時用新一代二磷酸鹽作為干預因素，檢測其效果，為臨床防治該病患提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔60只，體重(2.71±0.25)kg，由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要設備試劑 二磷酸鹽(利塞磷酸鈉，Risedronate)(美國LKT laboratories Inc.)，鼠抗兔MMP-13單抗由武漢博士德公司提供，鼠抗兔MMP-9單抗由北京博奧森生物科技公司提供，鼠抗兔組織蛋白酶K(CK)一抗抗體由上海泛柯化學試驗公司購得。

1.3 模型復制及處理 所有動物按隨機數字表法分為對照組(n=24)，模型組(n=24)，二磷酸鹽組(n=12)。二磷酸鹽組造模后每天皮下注射二磷酸鹽(利塞磷酸鈉，Risedronate sodium)0.01 mg/kg體重，模型組和對照組給以等體積的生理鹽水皮下注射。2% 戊巴比妥鈉按30 mg/kg麻醉，取髕骨內側切口。模型組和二磷酸鹽組暴露前交叉韌帶，中間切除約5 mm。對照組同法暴露前交叉韌帶，不予切斷。術后5 d腹腔注射頭孢唑啉鈉500 mg/d預防感染。模型組和二磷酸鹽組分別在造模后4 W、8 W、12 W各取8只，對照組取4只空氣栓塞處死。截取包括股骨遠端關節(jié)面的骨段。進行軟骨MMP-13免疫組化染色，軟骨下骨MMP-9和CK免疫組化染色。

1.4 關節(jié)軟骨MMP-13及軟骨下骨MMP-9，CK免疫組化染色檢測 取股骨內側髁遠端負重關節(jié)面軟骨用于MMP-13免疫組化染色，取軟骨下骨段(帶關節(jié)軟骨)用于MMP-9和CK免疫組化染色。標本4%多聚甲醛固定，脫鈣，系列酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，層厚5 μm連續(xù)冠狀面切片。參照Pellerier［1］的方法在軟骨切片中隨機選擇6個高倍鏡視野(400倍)其中3個位于軟骨表層和中上層，另3個位于軟骨中下層和下層，計算每個視野中的陽性細胞數和細胞總數。用細胞分數即陽性細胞數占細胞總數的百分比來表示MMP-13的表達量。軟骨下骨MMP-9，CK通過光鏡下觀察，細胞結構清楚，胞漿內有棕黃色顆粒且著色明顯高于背景者為陽性。陽性計數:各組組織標本切片，每間隔一個高倍視野選取一個視野進行觀察，每張切片觀察5個高倍視野，計算陽性細胞表達數目，取其平均值。陽性細胞數＜25%為陽性(-)，25% ～50%為弱陽性(+)，50% ～75%為陽性(++)，＞75%為強陽性(+++)。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件對資料進行分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，率的比較用卡方檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01為差異有非常統計學意義。

2 結果

2.1 造模術后不同時期關節(jié)軟骨內MMP-13表達 模型組軟骨內均可見較多的MMP-13表達陽性細胞，差異有統計學意義(P＜0.01)。關節(jié)軟骨全層均見有MMP-13表達，為深棕褐色顆粒。4W時模型組MMP-13較正常和二磷酸鹽干預組明顯升高(P＜0.01)，而8W和12W較4W時反而有所下降。二磷酸鹽干預組，陽性顆粒散在、顯色淺棕黃色。四周時對照組，模型組和二磷酸鹽組細胞陽性表達率為8%、94%和12%。和對照組相比，模型組陽性細胞表達數目明顯增多(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細胞陽性表達。與模型組比較，二磷酸鹽組陽性細胞表達數目明顯減少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W的陽性細胞表達平均數目見表1。從表中見到模型組陽性細胞表達平均數較對照組和二磷酸鹽組高，有統計學意義。說明二磷酸鹽干預效果明顯。但隨著時間延后，MMP-13陽性細胞表達逐漸減少。

2.2 造模后不同時期軟骨下骨MMP-9表達 各組軟骨下骨都有陽性細胞表達。細胞結構清晰，胞漿內有深淺不同的淺棕黃色到深棕褐色的顆粒，且著色明顯高于背景，模型組顯色深、有的聚集成簇，正常對照組和二磷酸鹽組陽性細胞表達少，散在，顯色淺。四周時對照組，模型組和二磷酸鹽組陽性細胞平均數目為分別為(1.34±0.1668)，(17.35±1.5430)，(3.34±0.1961)，細胞陽性表達率為4%、90%和16%。和對照組相比，模型組陽性細胞表達數目明顯增多(P＜0.01)，細胞陽性表達率也明顯升高(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細胞陽性表達。與模型組比較，二磷酸鹽組陽性細胞表達數目和表達率均明顯減少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W時的陽性細胞表達平均數目及表達率見表2。從表中見到模型組陽性細胞表達平均數及陽性表達率均較對照組和二磷酸鹽組高，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明二磷酸鹽干預效果明顯。12W較4W時比較差異有統計學意義(P＜0.01)，說明隨著時間延后，MMP-9陽性細胞表達逐漸減少。

2.3 造模后不同時期軟骨下骨組織蛋白酶K(CK)的表達變化 由各組數據及圖可見，各組軟骨下骨CK檢測都有陽性細胞表達。細胞結構清晰，模型組胞漿內見棕黃色到深棕褐色顆粒。正常對照組和二磷酸鹽組陽性細胞表達少。四周時對照組，模型組和二磷酸鹽組在高倍視野(×400)下陽性細胞平均數目分別為(1.66±0.1696)，(18.54±1.4180)，(4.05±0.1946)。細胞陽性表達率分別為8%、90%、12%。和對照組相比，模型組陽性細胞表達數目明顯增多(P＜0.01)，細胞陽性表達率也明顯升高(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細胞陽性表達，與模型組相比，二磷酸鹽組陽性細胞表達數目和陽性表達率明顯減少(P＜0.01)。4 W、8 W、12 W時的CK陽性細胞表達數目和表達率見表3，從表中見到模型組陽性細胞表達數目和陽性表達率均較二磷酸鹽組及對照組高。組間比較，有統計學意義。但隨著時間延長，CK表達的陽性細胞數目逐漸減少，12 W時的表達較4 W時表達顯著減少(P＜0.01)?！纒)

表1 兔膝關節(jié)不穩(wěn)不同時期軟骨MMP-13表達變化比較(x ± s，%)

表2 兔膝關節(jié)不穩(wěn)不同時期軟骨MMP-9表達變化比較(

表3 兔膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨組織蛋白酶K表達變化(

3 討論

骨關節(jié)炎(OA)是一種退行性關節(jié)病，成為老年人群面臨的主要疾病，嚴重影響患者的生活質量［3］。骨關節(jié)炎發(fā)生的許多因素中生物學因素一直是研究的重點，對關節(jié)軟骨各種成分的合成與分解平衡至關重要?；|金屬蛋白酶(MMPs)廣泛存在于各種結締組織中，被分為膠原酶、明膠酶、基質溶解素等五大類，其中MMP-13廣泛存在于骨關節(jié)患者的關節(jié)軟骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型膠原的作用是其他膠原酶的10-30倍，被認為是裂解Ⅱ型膠原纖維作用最強的酶，在OA的形成中起關鍵作用。而且其他許多MMP亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過它們起作用［4］。本實驗中我們發(fā)現 OA模型組MMP-13在術后4周時有強烈的表達，術后8周時表達逐漸減弱，12周時MMP-13表達繼續(xù)下降，說明其對關節(jié)軟骨降解作用減弱。MMP-13表達不隨軟骨退變加重而持續(xù)增強的原因目前尚不清楚，可能與其調控途徑不同有關。同時見到二磷酸鹽組有MMP-13的明顯減少，說明利塞磷酸鈉對MMP-13的表達有明顯的抑制作用。增加Ⅱ型膠原的含量，改善軟骨結構，從而改變了軟骨的退變進程［5］。

MMP-9是明膠酶中的一個重要元素，它能夠將膠原酶變性裂解的Ⅱ型膠原進一步裂解。軟骨下骨的MMP-9來源于破骨細胞，當其異常增多時表現軟骨下骨的過度吸收，引起軟骨下骨力學性能下降，抵抗外力作用下降，而同時產生的軟骨下骨代償性增生，又引起骨質硬化，骨重塑增多。使軟骨下骨硬度不均勻，不能均勻傳導來自關節(jié)軟骨的沖擊力，最后導致關節(jié)軟骨損傷［4］。本實驗中我們觀察到，模型組術后4W、8W、12W軟骨下骨MMP-9陽性細胞表達數目和陽性表達率明顯較對照組和二磷酸鹽增多，差異有統計學意義。提示OA模型早期破骨細胞增多，有明顯的骨吸收，二磷酸鹽組明顯抑制了MMP-9的表達，大體與組織學結果顯著好于模型組，顯示了二磷酸鹽通過抑制MMP-9的表達減少軟骨下骨的骨轉換，防止軟骨下骨重塑，減少骨硬化，進而改善和維持關節(jié)軟骨的營養(yǎng)代謝及生物力學環(huán)境。而隨著時間的延長，8W、12W模型組的MMP-9陽性表達數目和陽性表達率逐漸減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示隨著OA的進展骨吸收作用逐漸減弱，其機制仍不是完全清楚。

組織蛋白酶是破骨細胞分泌的一種溶酶體酶，其生理作用底物是有機骨基質中含量豐富的ColI。它通過作用于ColI蛋白的N端及C端三股螺旋處而降解骨纖維膠質，它對成骨膠原的降解能力遠遠高于其他各種金屬蛋白酶(MMPs)，是骨吸收過程中的一個關鍵酶。破骨細胞分泌的組織蛋白酶K的前體蛋白在骨吸收腔隙中被激活，參與骨質的代謝。最近有報道組織蛋白酶K可能是哺乳動物中唯一能降解骨纖維膠原的蛋白酶，CK的表達伴隨著整個破骨細胞分化的過程，由破骨細胞介導的骨吸收作用絕對或相對的增加超過成骨細胞的骨形成作用所導致的骨量持續(xù)丟失［6］。本實驗中我們觀察到，模型組術后4W、8W、12W組織蛋白酶K陽性細胞表達數目和陽性表達明顯增多，顯示關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨層破骨細胞增多，酶的表達增加，與MMP-9的表達類似。顯示骨吸收作用下降。由于組織蛋白酶K對軟骨下骨吸收的明顯效能，因此對于如何抑制其骨吸收作用成為眾多學者的研究課題，Wittrant［7］等學者進行的研究證明骨保護素是一種CK抑制劑。國內學者在用中醫(yī)中藥方法抑制CK的骨吸收方面也取得了可喜的成績，他們用骨碎補總黃酮［8］、金雀異黃素［9］抑制CK的表達取得明顯效果。我們在本實驗中觀察到，二磷酸鹽利塞磷酸鈉組CK表達較模型組明顯減少(P＜0.01)，和正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，顯示其有明顯的抑制破骨細胞CK表達的作用，減少CK產生，減少軟骨下骨吸收，改善軟骨下骨力學性能。從而保護關節(jié)軟骨。

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