王艷秋 高陽 張曼 李德華

纖維軟骨的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為基質(zhì)內(nèi)含有90%以上的Ⅰ型膠原和少量Ⅱ型膠原，軟骨細(xì)胞較小而少，這是與透明軟骨的主要區(qū)別［1］。纖維軟骨主要位于椎間盤的纖維環(huán)和膝關(guān)節(jié)的半月板等，結(jié)構(gòu)和功能非常重要，其損傷破裂和退行性變都會(huì)引起嚴(yán)重的臨床癥狀，組織工程學(xué)的修復(fù)和再生治療為此提供了新思路。

人真皮成纖維細(xì)胞(Human Dermal Fibroblasts，hDFs)是結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，能合成和分泌大量的Ⅰ型膠原和基質(zhì)成分。致密的真皮層hDFs儲(chǔ)備豐富，可以通過簡(jiǎn)單的活檢手術(shù)取材，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，自體取材不涉及倫理學(xué)問題，是構(gòu)建組織工程纖維軟骨的首選種子細(xì)胞［2］。

研究表明生長分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF-5)是目前誘導(dǎo)成體間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的最有效生長因子［3］。因此，探討應(yīng)用GDF-5誘導(dǎo)hDFs分化為軟骨樣細(xì)胞意義重大。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用GDF-5誘導(dǎo)hDFs向軟骨樣細(xì)胞分化，并從形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討hDFs作為組織工程纖維軟骨的種子細(xì)胞的可行性，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程纖維軟骨提供種子細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 人真皮組織來自5例行除皺術(shù)的健康成年女性患者，年齡30～45歲，無傳染病和內(nèi)分泌疾病，并簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 L-DMEM、MTT、DMSO(Gibco);Ⅰ型膠原酶、L-脯氨酸、抗壞血酸、地塞米松、胰島素、甲苯胺藍(lán)(Sigma);GDF-5(PeproTeeh Inc);兔多抗Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體、SABC試劑盒(博士德生物試劑公司)。

1.3 hDFs的分離與培養(yǎng) 取成人除皺術(shù)后的皮膚組織，消毒，PBS漂洗，剪成0.5～1 mm3的小塊，Ⅰ型膠原酶室溫消化3 h，200目篩網(wǎng)過濾并收集消化液，1000 r/min離心5 min，棄上清液。用L-DMEM液混懸，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3 d換液，達(dá)90%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.4 hDFs的增殖活性檢測(cè) 取P3、P6、P10的hDFs，胰酶消化，以1×104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，于7 d內(nèi)的每24 h取出一板，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 150 μl，震蕩 10 min，用酶聯(lián)免疫儀(Bio-Rad Model 680;美國)選擇570nm波長測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)。

1.5 檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá) 取P3的細(xì)胞行細(xì)胞爬片，達(dá)90%融合時(shí)，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-100孵育，3%H2O2室溫孵育，5%BSA封閉，兔多抗Ⅰ型膠原(1:200)，4℃孵育過夜，滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡觀察。結(jié)果判定:細(xì)胞胞漿內(nèi)可見不同程度的棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.6 誘導(dǎo)hDFs分化為軟骨樣細(xì)胞 取P3的hDFs，胰酶消化，以5×105/孔的細(xì)胞懸液接種于六孔板，細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液:含10%FBS的H-DMEM、100ng/ml GDF-5、10-7mol/L 地塞米松、37.5 mg/L 抗壞血酸、1 μmol/L胰島素，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液，相差顯微鏡觀察。

1.7 檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá) 取誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2室溫孵育，5%BSA封閉后加入兔多抗Ⅱ型膠原(1:200)，4℃過夜。滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察。結(jié)果判定:細(xì)胞胞漿內(nèi)可見不同程度的棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.8 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)GAG 取誘導(dǎo)28 d細(xì)胞爬片，PBS漂洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min。自來水沖洗15 min，蒸餾水洗5 min，加1%甲苯胺藍(lán)2 h，95%乙醇去除多余染液。干燥后，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0軟件，采用One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 hDFs的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的hDFs于接種24 h就有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形或紡錘形。3 d后細(xì)胞逐漸增多緊密排列。10 d左右細(xì)胞達(dá)到90%融合(圖1)。傳代細(xì)胞增殖明顯，3～5 d即達(dá)90%融合。P10以后，增殖速度仍未減慢。

圖1 原代培養(yǎng)10 d的hDFs(相差顯微鏡×100)

2.2 hDFs的生長曲線 MTT結(jié)果表明傳代培養(yǎng)的hDFs在1～2 d為潛伏期，增殖較慢;2～4 d為對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞增殖加快并逐漸融合;于第4 d進(jìn)入生長平臺(tái)期并達(dá)峰值。P3，P6，P10的細(xì)胞生長曲線均呈“S”形(圖2)。數(shù)據(jù)分析表明3種不同代數(shù)的hDFs在相同時(shí)間的OD值沒有明顯差異(P＞0.05)，說明傳至第10代的hDFs仍能快速生長，增殖活性并未下降。

圖2 傳代hDFs的生長曲線

2.3 Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 P3的hDFs行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見大部分細(xì)胞胞核染成藍(lán)色，胞漿呈棕黃色陽性表達(dá)，表明原代培養(yǎng)的細(xì)胞能分泌Ⅰ型膠原，具備成纖維細(xì)胞的特性(圖3)。

圖3 hDFsⅠ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×100)

2.4 成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 hDFs在GDF-5的誘導(dǎo)下細(xì)胞形態(tài)明顯改變，10 d時(shí)細(xì)胞由長梭形逐漸變?yōu)槎嘟切危?1 d時(shí)細(xì)胞開始變圓或卵圓形并呈聚集樣生長，形成類軟骨樣結(jié)節(jié)(圖4)。

圖4 誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞(×100)

2.5 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 GDF-5誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞行Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見大部分細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿呈棕黃色陽性表達(dá)，表明GDF-5誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備分泌Ⅱ型膠原的功能，符合軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原的特性(圖5)。

2.6 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)GAG 經(jīng)GDF-5誘導(dǎo)28 d細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色，可見大部分細(xì)胞被染成藍(lán)色，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞可以分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分GAG，具備軟骨樣細(xì)胞的特性和功能(圖6)。

圖5 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×100)

圖6 甲苯胺藍(lán)染色(×100)

3 討論

種子細(xì)胞是組織工程學(xué)的第一要素，自體軟骨細(xì)胞來源及體外擴(kuò)增受限，無法廣泛應(yīng)用于臨床［4］。hDFs是結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，通過有絲分裂大量增殖，并合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，參與人體創(chuàng)口的修復(fù)工作。它合成的前膠原蛋白分子經(jīng)內(nèi)切酶作用，聚合和重排，可形成具有64nm周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經(jīng)互相粘合形成Ⅰ型膠原纖維。hDFs可以通過簡(jiǎn)單的活檢手術(shù)取材，并且致密的真皮層hDFs儲(chǔ)備豐富，分離、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單而且細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，可以自體取材不涉及倫理學(xué)問題，容易增殖［5］。因此，hDFs具有作為種子細(xì)胞的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養(yǎng)hDFs，細(xì)胞呈長梭形，渦輪狀緊密排列。傳代細(xì)胞生長形態(tài)均一，P10代以后的細(xì)胞仍具有很強(qiáng)的增殖能力。hDFs可以分泌Ⅰ型膠原蛋白，這在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色有棕黃色的陽性表達(dá)，說明本實(shí)驗(yàn)原代分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合成纖維細(xì)胞的特性，屬于hDFs。

探討應(yīng)用GDF-5將hDFs誘導(dǎo)分化為具有功能性的軟骨樣細(xì)胞是本研究的重點(diǎn)。GDF-5是TGF-β超家族中的一員，它可促進(jìn)早期軟骨和關(guān)節(jié)形成，是目前誘導(dǎo)成體間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的最有效生長因子［6］。因此本研究配制的軟骨誘導(dǎo)液是含GDF-5的高糖DMEM等混合物。本實(shí)驗(yàn)GDF-5的濃度依報(bào)道［3］選用100ng/ml，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)液中含有胰島素可促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞存活、有絲分裂、糖原合成;丙酮酸鈉是細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源;BSA和脯氨酸作為細(xì)胞的營養(yǎng)成分，可促進(jìn)細(xì)胞合成膠原;谷胺酰胺可補(bǔ)充必需氨基酸;維生素C是抗氧化劑，可抑制或減少細(xì)胞調(diào)亡［7］。

應(yīng)用軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，hDFs由長梭形逐漸變?yōu)轭悎A形，并在某些區(qū)域聚集生長，形成軟骨樣結(jié)節(jié)，表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備了軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征。同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行軟骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性蛋白［8］，本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)28 d后細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯示細(xì)胞胞漿呈棕黃色陽性表達(dá)，核藍(lán)染，說明經(jīng)此誘導(dǎo)培養(yǎng)hDFs具備軟骨細(xì)胞分泌特異性蛋白的生物學(xué)特性。GAG是軟骨組織中含量最大的蛋白聚糖［9］，是軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分。本實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，可見大部分細(xì)胞被染成藍(lán)色，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞可以分泌GAG，具備軟骨樣細(xì)胞的特性和功能

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從人真皮組織中成功分離培養(yǎng)hDFs，獲取的細(xì)胞數(shù)量多、體外增殖迅速，可分泌合成Ⅰ型膠原。在GDF-5的誘導(dǎo)下可分化為軟骨樣細(xì)胞，具有軟骨細(xì)胞形態(tài)，合成分泌了軟骨細(xì)胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖。因此，hDFs可以作為組織工程軟骨的種子細(xì)胞。以后的研究可以應(yīng)用hDFs的已軟骨分化形式和未分化形式相結(jié)合的方法，共同作為組織工程纖維軟骨的種子細(xì)胞，為成功構(gòu)建組織工程纖維軟骨找到理想的種子細(xì)胞。

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