劉長琦 (第一汽車集團(tuán)公司總醫(yī)院，吉林 長春 130011)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的32.26% ～60.96%〔1〕，即使采用多種治療手段，包括手術(shù)、放療和化療，預(yù)后仍極差，死亡率很高〔2〕。近年來，以惡性腫瘤相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的基因治療倍受研究者的青睞。CXCR4是組織表達(dá)最為廣泛的細(xì)胞因子受體之一，在乳腺癌、卵巢癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和腦膜瘤等至少20種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)〔3〕，并且其表達(dá)水平隨著病理級別的增高而升高。本文在構(gòu)建、篩選有效的CXCR4 shRNA的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，觀察其對U251細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討CXCR4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征影響的可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株(吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院保存)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒及Trizol試劑購于Invitrogen公司;RT-PCR二步法試劑盒購自Fermentas公司;CXCR4-shRNA載體pGPU6/GFP/Rac1-421由本室構(gòu)建、篩選。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 冷凍保存于液氮中的U251細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞以1×106個/孔接種于無菌6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA載體的 pGPU6/GFP/Rac1-421組、轉(zhuǎn)染非特異的 PGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組，按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染shRNA 48 h后，各組細(xì)胞胰酶消化，預(yù)冷PBS洗滌2次后重懸收集細(xì)胞，加入－20℃ 的85%乙醇，4℃固定過夜。PBS洗滌，加PI染液，避光，置于室溫30 min后上機(jī)，檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3 RT-PCR檢測各組細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后取各組細(xì)胞，按Trizol試劑盒抽提總RNA，分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR引物由上海英駿生物科技有限公司提供。Bcl-2引物:5'-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3';5'-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3'，擴(kuò)增片段大小304 bp;Bax引物:5'-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3';5'-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3'，擴(kuò)增片段209 bp，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參引物:5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3';5'-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGT-3'，擴(kuò)增片段471 bp。PCR擴(kuò)增后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用圖像掃描儀拍照并進(jìn)行條帶灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示mRNA相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4 shRNA對U251細(xì)胞凋亡的作用 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，pGPU6/GFP/Rac1-421組、pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組凋亡率分別為(8.42±2.82)%、(5.27±0.85)%、(3.99±1.31)%;pGPU6/GFP/Rac1-421組凋亡率最高(P＜0.05);pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 CXCR4 shRNA對U251細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響 1.5%凝膠電泳顯示三組細(xì)胞PCR產(chǎn)物，條帶與目的擴(kuò)增產(chǎn)物長度一致(圖1)，用Quantity One圖像分析軟件分析，pGPU6/GFP/Rac1-421組的U251細(xì)胞Bcl-2 mRNA顯著低于相對于pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。pGPU6/GFP/Rac1-421組的U251細(xì)胞Bax mRNA顯著高于pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 RT-PCR檢測各組U251細(xì)胞中Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)的變化(±s)

表1 各組細(xì)胞Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)的變化(±s)

與pGPU6/GFP/NC組和未轉(zhuǎn)染組比較:1)P＜0.05

1 081.27±79.49 1 336.56±159.96 pGPU6/GFP/NC組 978.60±97.50 1 541.33±165.51 pGPU6/GFP/Rac1-421組 580.78±89.901) 2 066.62±123.37*Bcl-2 Bax未轉(zhuǎn)染組組別

3 討論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后很差，而且腦膠質(zhì)瘤對化療藥物往往不敏感或者耐藥，因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。siRNA技術(shù)是近年發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，可以完全下調(diào)特定蛋白的表達(dá)能力，對特定基因產(chǎn)生基因抑制作用，已成為當(dāng)前腫瘤治療研究的一個重要手段〔4〕。

CXCR4/SDF-1軸與多種腫瘤細(xì)胞的惡性表現(xiàn)密切相關(guān)，不僅在腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，而且與腫瘤細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。劉佳鑫等〔5〕認(rèn)為膠質(zhì)瘤可能利用SDF-1與CXCR4的結(jié)合使癌細(xì)胞侵入正常組織形成轉(zhuǎn)移腫瘤，這無疑為膠質(zhì)瘤研究開辟了一個新的天地。

正常情況下細(xì)胞增殖與凋亡保持著動態(tài)平衡，而惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)的增生異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此通過調(diào)控靶基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖是腫瘤基因治療的一個機(jī)制。研究表明CXCR4的特異性siRNA能夠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯〔6〕，抗 CXCR4 單克隆抗體促進(jìn)胃癌、乳腺癌細(xì)胞凋亡〔7，8〕。本研究結(jié)果證實(shí)CXCR4 shRNA可誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且明顯增加其凋亡率。提示CXCR4 shRNA可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制瘤細(xì)胞的增殖。

Bcl-2與Bax是野生型p53的下游基因，是目前研究較為深入的凋亡調(diào)控基因。Bcl-2為凋亡抑制基因，其活性增高，可抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生命〔9〕，而Bax與Bcl-2蛋白質(zhì)有一定的相似性。Bax是一種促凋亡基因〔10〕，抑制細(xì)胞增殖。因此，同時檢測Bcl-2和Bax更能全面反映它們對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明凋亡相關(guān)基因 Bcl-2與 Bax在CXCR4 shRNA促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮非常重要的作用。綜上研究，CXCR4 shRNA可通過調(diào)控Bcl-2與Bax的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，CXCR4有望成為膠質(zhì)瘤基因治療中的新靶位。

1 王忠誠.神經(jīng)外科學(xué)〔M〕.第5版.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2005:512.

2 Wen PY，Kesari S.Malignant gliomas in adults〔J〕.N Engl J Med，2008;359(5):492-507.

3 Duda DG，Kozin SV，Kirkpatrick ND，et al.CXCL12(SDF1alpha)-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition:an emerging sensitizer for anticancer therapies〔J〕.Clin Cancer Res，2011;17(8):2074-80.

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5 劉佳鑫，王崇謙，王偉民，等.SDF-I/CXCR4在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲中的作用〔J〕.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013;1:23-7.

6 王 艷，劉曉日，譚艷芳，等.RNA干擾沉默CXCR4基因?qū)urkat細(xì)胞周期和凋亡的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010;3:625-8.

7 羅 君，吳小翎.抗CXCR4單克隆抗體對胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響〔J〕四川醫(yī)學(xué)，2008;29(2):137-40.

8 馬大昌，武 力，王育成，等.CXCR4單克隆抗體對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的影響〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2006;14(11):1383-6.

9 Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis〔J〕.Mol Cell Biochem，2011;351(1-2):41-58.

10 Westphal D，Dewson G，Czabotar PE，et al.Molecular biology of Bax and Bak activation and action〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1813(4):521-31.