李 蕾 陳黎明 趙傳艷 崔連群 (山東大學附屬省立醫(yī)院心內科，山東 濟南 250012)

血管內皮生長因子 (VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管形成促進劑之一。已有報道用于缺血性心臟病的治療〔1～3〕。刺激VEGF分泌的主要因素有缺血、缺氧、炎癥因子等，最主要的因素之一是缺血、缺氧〔4〕。VEGF與基質金屬蛋白酶(MMPS)之間可能有相互促進作用。含iv型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 (ADAMTS)與MMPS同屬于金屬蛋白酶家族，其中ADAMTS4、ADAMTS5均能降解蛋白聚蛋白多糖。目前尚無VEGF對體外培養(yǎng)內皮細胞MMPs及ADAMTS4、ADAMTS5表達的報道。本實驗模擬冠心病缺血缺氧狀態(tài)下VEGF分泌增加，且與缺血缺氧嚴重程度分泌相一致，觀察VEGF對內皮細胞MMP-9及ADAMTS4、ADAMTS5表達及活性的影響，探討VEGF和MMP-9、ADAMTS-5、ADAMTS4的作用及其與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定之間的可能關系。

1 材料與方法

1.1 試劑 人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，rhVEGF165(PEPROTECH公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、血清、胰酶(Hyclone公司)，RNAiso Plus(TaKaRa)，RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)，SYBR GreenI RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，RIPA 裂解液(強)(碧云天)，PMSF(碧云天)，4倍蛋白上樣緩沖液(Solarbio)，PVDF 膜，ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9單克隆抗體(R＆D SYSTEM)，GAPDH一抗(杭州賢至科技)，抗鼠辣根過氧化物酶標記二抗 (北京中杉)，BeyoECL Plus化學發(fā)光試劑盒(碧云天)。

1.2 儀器 美國Specltramax酶標儀，倒置顯微鏡，DM4000B光學顯微鏡，QwinV3圖像分析軟件(德國Leica公司)，日本Image Reader LAS-4000凝膠成像儀，Multi gaugeV3.2圖像分析軟件，美國Bio-Rad PCR儀，Light Cycler 480Ⅱ PCR儀。

1.3 血管內皮細胞培養(yǎng) 將HUVEC細胞懸浮于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，90%1640培養(yǎng)基，青鏈霉素終濃度100 U/ml)恒溫溫箱37℃孵育培養(yǎng)3 d，傳代后，待細胞進入生長力旺盛、狀態(tài)良好的對數生長期，換用0.5%胎牛血清(BSA)的培養(yǎng)基同時加入 rhVEGF165，使其終濃度為0，10，20，50 ng/ml，恒溫孵育培養(yǎng)24 h，分別提取總RNA及細胞總蛋白。

1.4 Real Time-PCR 上述細胞每107個內皮細胞用1 ml RNAiso Plus抽提細胞總RNA，并用分光光度計測量其濃度，用A260/A280值在1.8～2.0確定其純度，取500 ng總RNA作為模板，照逆轉錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，取稀釋3倍后的 cDNA 5 μl為模板，加入 ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9、β-ac-tin上下游引物各1 μl及10 μl SYBR Green熒光定量PCR體系，95℃ 5 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 1 min，45 個循環(huán);并進行溶解曲線測試。應用Light Cycler 480Ⅱ 系統(tǒng)擴增，結果采用2－ΔΔct分 析。ADAMTS-5，上 游 5'-TCGTAGGTCTGTCCTGGGAGTTC-3'，下 游 5'-AATGCACTTCAGCCACCATCA-3';ADAMTS-4上游5'-GACACGCTGGGTATGGCTGA-3'，下游5'-ACTGATGCATGGCTTGGAGTTG-3';MMP-9上游5'-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3'，下游 5'-CCAAACTGGATGACGATGTC-3';β-actin上游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下游5'-CTA AGTCAT AGT CCG CCT AGA-AGCA-3'。

1.5 Western印跡 提取上述細胞總蛋白，測濃度后蛋白變性，取蛋白50 μg加入4倍蛋白上樣緩沖液總體積約10 μl上樣，以5%濃縮膠、10%分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，70 V，30 min，預電泳，30 V，60 min，一階段電泳，100 V，70 min 二階段電泳，至溴酚藍遷移至凝膠底部后，100 V，90 min轉移至PVDF膜，10%牛奶封閉1 h，加入 AMAMTS5(1∶250)一抗、ADAMTS4(1∶200)一抗、MMP9(1∶200)、β-Actin(1∶800)一抗 4℃搖床上孵育過夜，PBST洗膜 10 min×3，加 HRP標記羊抗鼠 IgG(1∶10 000)，室溫搖床上孵育 1 h，PBST 洗膜 10 min ×3，Image Reader LAS 4 000顯影儀上進行發(fā)光顯影，并進行分析，測定各蛋白平均光密度值，并求得各蛋白帶與β-actin比值。

1.6 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS17.0，數據用±s表示，不同組間比較采用one way-ANOVA分析。

2 結果

2.1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達變化 不同處理組間，隨著 rhVEGF165 刺激濃度 0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達逐步升高(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達水平

2.2 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9在轉錄水平表達變化 不同處理組間，隨著 rhVEGF165 刺激濃度0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表達有增強趨勢(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各濃度rhVEGF-65刺激后ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9 轉錄水平

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊肩部及脂質核心處，MMP-9活性增高，其通過降解纖維帽中的膠原和基質，使纖維帽逐漸變薄，斑塊易損性增加〔5〕。ADAMTS4、ADAMTS5結構及蛋白水解作用類似于 MMPs〔6～9〕，最近有研究證實 ADAMTS4在外周血抗原水平隨著冠心病嚴重程度逐漸加重，且與冠狀動脈復雜病變的數量存在正相關，活性可被TIMP3阻斷，同時表明ADAMTS4通過降解蛋白多糖verican/aggrecan導致斑塊不穩(wěn)定，并闡明了ADAMTS-4在急性冠脈綜合征中的診斷價值及其誘導斑塊不穩(wěn)定的機制〔10〕。

VEGF除了能高效的促進內皮細胞的分裂和增殖，抑制多種因素導致的內皮細胞凋亡，使內皮細胞快速修復，并能間接抑制血管平滑肌的增殖遷移〔11〕。本實驗首次證實了 VEGF可以促進血管內皮細胞 MMP-9、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達及蛋白合成，促進其活性增強。其機制可能為:①隨著粥樣硬化進展，內皮細胞功能受損，機體缺血缺氧而產生的VEGF，通過多種復雜機制誘導產生蛋白酶，如纖溶酶、纖溶酶原激活物、MMPs、ADAMTS等，使基質蛋白被酶水解，導致斑塊易損性增強;②導致動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定并加速其進展的另一主要機制是斑塊內出血，VEGF刺激引起小的、易損血管在進展期斑塊內形成，導致斑塊內出血，引起急性癥狀。上述三種蛋白酶作用均可被TIMP3抑制，提示利用TIMP-3生物活性劑阻斷ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9有望成為治療動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的一條新途徑。

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