王長山 李 麗 金紹靜 朱金玲 張玉萍 朱喜科 (佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

胸腺微環(huán)境是一個高度異質性的三維網絡，主要構成有骨髓淋巴造血祖細胞起源的胸腺細胞和非骨髓淋巴造血祖細胞起源的胸腺上皮細胞(TECs)，為胸腺細胞的發(fā)育提供了獨特的微環(huán)境。而哺乳動物在青春期后胸腺的重量與年齡增長呈負相關〔1〕，即胸腺隨著年齡增長發(fā)生明顯萎縮，這種現象稱為胸腺增齡性萎縮。Foxn1是翼狀螺旋/叉頭轉錄因子家族成員，在皮膚和TECs表達，在胸腺器官發(fā)生中促進TECs表達并調控TECs分化和增殖。Foxn1基因缺失導致了嚴重的胸腺發(fā)育不全和免疫缺陷〔2〕。本項目以不同年齡階段的C57BL/6小鼠為研究對象，探討Foxn1的表達在胸腺增齡性萎縮調控中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 實驗選用SPF級C57BL/6小鼠，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心和四川成都達碩生物科技有限公司。許可證號分別為:SCXK-(軍)2007-004;SCXK-(川)2008-24。按年齡隨機分為青齡組(1月齡)、中青齡組(4月齡和6月齡)、中齡組(12月齡)和老齡組(18月齡)。每月齡組中雌雄各6只。

1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀;VILBER凝膠成像儀;YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺;DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。Trizol Reagent/總RNA提取液(Invitrogen公司);Trizol總RNA提取液、PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBRR Premix Ex TaqTM試劑盒、Real time quantitive PCR引物(購自大連寶生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腺指數及胸腺細胞計數檢測 C57BL/6小鼠稱重，無菌條件下麻醉，剖開胸腔，摘取胸腺稱量，按公式計算胸腺指數。胸腺指數=胸腺重量(mg)/〔體重(g)×10〕。

剪切胸腺小葉至小碎片，37℃在含有0.125%膠原酶D(roche diagnostics)、0.1%DNase I(roche diagnostics)混合物的1640培養(yǎng)基中處理10 min，振蕩2～3次，重復此步驟2～3次至組織溶解。收集細胞，200目篩網(75 μm)濾過后1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl PBS混勻用于細胞計數。在冷PBS中撕破胸腺被膜并振蕩數次去除胸腺內的淋巴細胞。然后放入DMEM培養(yǎng)基中在4℃繼續(xù)攪拌1 h。進一步用含有5 U/ml DNase I的1 mg/ml膠原酶Ⅳ(roche，indianapolis，IN，USA)DMEM 溶液在 37℃消化 10 min，振蕩 2～3次。此步驟可以重復1～2次直到所有組織被溶解。溶解的細胞，用鼠抗CD45抗體染色，再和結合有抗鼠IgG的免疫磁珠(militenyi biotec)反應，所獲得的細胞過LS磁柱收集，通過磁柱的細胞為胸腺上皮細胞。

1.3.2 Real-time RT-PCR擴增TECs內Foxn1 胸腺基質細胞總RNA提取:向收集的106～107胸腺基質細胞的Eppendorf管中加入1 ml Trizol，裂解 5 min。Eppendorf管中加入 200 μl氯仿，用力振蕩，室溫靜置5 min。10 000 r/min 4℃離心15 min，棄上清，移至新的Eppendorf管內，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min。10 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加入70%DEPC處理水配制乙醇1 ml，輕輕洗滌管壁。10 000 r/min 4℃離心10 min，棄乙醇，室溫真空干燥5 min。加入RNase-free水(DEPC 處理水)30～50 μl，溶解沉淀。取1 μl總 RNA 用紫外分光光度計測260 nm及280 nm的吸光度值，檢測提取RNA的重量及產量。總RNA－80℃保存?zhèn)溆?。取OD260/OD280在1.8～2.0之間的RNA用于實驗。

Real-time PCR反應:采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別擴增目的基因(Foxn1 mRNA)和管家基因(GAPDH)，引物序列如表1所示。在同一次反應中，設置樣品Foxn1片段PCR組、樣品GAPDH片段PCR組、陰性對照組，每組設2個平行重復。反應結束后，設定閾值，軟件輸出Ct值;采用比較Ct值方法進行定量，公式為:2－ΔΔCt，其中 ΔΔCt=(Ct目的基因 －Ct管家基因)實驗組÷(Ct目的基因－Ct管家基因)對照組。

表1 Foxn1和GAPDH引物設計

1.4 統計學分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用t檢驗，組內比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠胸腺組織形態(tài)學結果隨著月齡增加，胸腺組織體積表現為明顯的逐漸減小趨勢，顏色也由乳白變黃白、表面光澤度下降 (圖1)。C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數和細胞數見表2。

表2 C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數及胸腺細胞數比較(± s，n=6)

表2 C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數及胸腺細胞數比較(± s，n=6)

與4月齡組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與12月齡比較:3)P＜0.01

組別 胸腺重量(mg)胸腺指數(mg/10 g體重)胸腺細胞數(×106)4月齡48.12±3.76 0.191±0.012 59.68±13.55 12月齡 30.48±6.601) 0.097±0.0231) 45.95±7.671)18月齡 7.15±2.412)3) 0.023±0.0082)3) 13.64±4.322)3)

4月齡較12月齡胸腺重量顯著減少(P＜0.05)，而12月齡又顯著低于18月齡(P＜0.01);4月齡與12月齡胸腺指數差異顯著(P＜0.05)，12月齡顯著低于18月齡(P＜0.01)。胸腺細胞計數結果顯示，4月齡較12月齡顯著減少(P＜0.05)，12月齡顯著少于18月齡(P＜0.01)。

2.2 C57BL/6小鼠胸腺基質發(fā)育相關基因Foxn1表達變化Real-time PCR檢測小鼠胸腺基質發(fā)育相關基因Foxn1表達，基因在其特異的熔解溫度有特異性熔解峰。結果表明，隨著年齡的增長Foxn1基因表達呈現明顯減少，1月齡(0.909±0.119)，6月齡(0.689±0.108)，12月齡(0.240±0.063)，18月齡(0.047±0.010)(P＜0.05)。

圖1 C57BL/6小鼠胸腺組織體積增齡性變化

3 討論

胸腺是哺乳動物中樞免疫器官，分泌多種胸腺激素等物質，促進T細胞分化、發(fā)育。胸腺自身沒有內源性自我更新的干細胞，需要定期從骨髓招募〔3，4〕。來源于骨髓的淋巴造血祖細胞(LPCs)在胸腺與TECs相互作用發(fā)育為幼稚T細胞，再接受陽性、陰性選擇，最終分化為成熟T細胞〔5，6〕。胸腺中完全發(fā)育的TECs組織包括皮質胸腺上皮細胞(cTECs)與髓質胸腺上皮細胞(mTECs)。這些區(qū)域為遷移的LPC在胸腺的發(fā)育為成熟的T細胞提供了一個獨特的內環(huán)境——胸腺微環(huán)境〔7，8〕。胸腺增齡性萎縮與胸腺微環(huán)境密切相關。胸腺增齡性萎縮減少了T淋巴細胞增殖和輸出，從而導致幼稚T細胞庫用盡和T細胞受體組分的收縮〔9〕。老齡胸腺中胸腺細胞已發(fā)生明顯退行性改變和凋亡。這樣就不可避免地減少對外來抗原的應答性，導致病原體清除延遲，增加了老年人罹患癌癥、自身免疫性疾病以及病毒、細菌等病原感染的危險〔10，11〕。

Foxn1是forkhead box(Fox)轉錄因子家族成員，Fox轉錄因子家族是一組翼狀螺旋/叉頭型轉錄因子家族，包含一個特有的forkhead DNA結合域。在人類發(fā)現有20多種forkhead基因，其在內胚層發(fā)育及內胚層來源的器官形成中發(fā)揮關鍵性調控作用。Foxn1基因位于小鼠第11號染色體，人類第17號染色體，由9個外顯子(exons)構成，其中exon 1為非編碼區(qū)，包括exon 1a和exon 1b。實驗證明這兩個外顯子的上游序列存在組織特異性的啟動子:exon 1a前的啟動子在胸腺和皮膚中均有活化，而exon 1b前的啟動子則只在皮膚中活化〔12〕。Foxn1是一個保守的轉錄因子，在人類和小鼠中均有648個氨基酸，其中85%的序列相同。

Foxn1是TECs發(fā)育中的轉錄因子，對于cTECs和mTECs的產生都是必須的，Foxn1在胸腺器官發(fā)生中促進TEC表達并調控 TEC 分化和增殖〔13，14〕，據報道，Foxn1－/－裸鼠，TECs 的發(fā)育受阻〔15〕。Foxn1－/－小鼠胸腺器官初期發(fā)育階段正常，其原基能形成，但淋巴造血干細胞不能遷入原基內。另外，Mori等〔16〕近來研究發(fā)現，Foxn1是小鼠胚胎胸腺內血管化所必需的。實驗表明，小鼠出生一周后，降低Foxn1的表達，會造成胸腺結構破壞和退化，皮髓質交界處嚴重損傷，TECs和T細胞產出減少等一系列生物功能影響，且這種影響是依賴于Foxn1劑量的，該依賴性對于高表達Foxn1的MHCⅡhiUEA-1himTECs尤為敏感〔17〕。Soza-Ried 等〔18〕構造了一種 loxP-fl oxed-Foxn1(fx)小鼠，其Foxn1表現為表達量逐漸減少直至消失，3～6個月fx小鼠胸腺開始萎縮，其胸腺形態(tài)大小類似于野生老齡小鼠(18～22個月)，在為野生老齡小鼠胸腺提供外源性Foxn1的cDNA，結果有效緩解了胸腺萎縮和外周 CD4+細胞功能的減退。

筆者對增齡C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺細胞數與Foxn1表達量的關系研究結果表明Foxn1不僅對胚胎期的胸腺發(fā)育起重要作用，而且對出生后的胸腺維持及衰老時的萎縮具有顯著影響。胸腺TECs提供T細胞發(fā)育成熟所必需的微環(huán)境，TECs內不同基因在特定時間和空間上的表達，形成復雜的網絡調控。這些復雜的事件和嚴格的調控決定了胸腺的生理功能。轉錄因子與信號轉導通路的相互作用中多數涉及Foxn1，轉錄因子Foxn1在胸腺TECs發(fā)育分化中起重要作用。Foxn1表達隨著年齡的增長呈顯著減少，可通過影響TECs分化和增殖，造成胸腺微環(huán)境惡化引起胸腺萎縮。

綜上所述，Foxn1參與了胸腺的形成、發(fā)育、成熟和退化萎縮各個階段，其表達水平在TECs不同的發(fā)育時期呈現不同的特點。對Foxn1的分子機制研究有利于闡明胸腺維持和退化萎縮機制，進一步為延緩胸腺增齡性萎縮和促進胸腺組織再生打下基礎。TECs分化、發(fā)育和凋亡涉及諸多信號通路的時序調控，如Wnt和BMP通路可能對TECs的Foxn1表達發(fā)揮重要調控作用。但是，目前對于Foxn1的上游信號通路和下游靶基因的理解仍很淺，有待深入研究。

1 Elcüman EA，Akay MT.Age-dependent immunolocalization of fibronectin and histological changes in the thymus of rats〔J〕.Vet Res Commun，1998;22(8):525-32.

2 Taub DD，Longo DL.Insights into thymic aging and regeneration〔J〕.Immunol Rev，2005;205:72-93.

3 Aspinall R，Pitts D，Lapenna A，et al.Immunity in the elderly:the role of the thymus〔J〕.J Comp Pathol，2010;142(Suppl 1):S111-5.

4 Yu S，Abel L，Globerson A.Thymocyte progenitors and T cells development in aging〔J〕.Meth Ageing Dev，1997;94(1-3):103-11.

5 Hirokawa K，Utsuyama M，Kobayashi S.Hypothalamic control of development and aging of the thymus〔J〕.Mech Ageing Dev，1998;100(2):177-85.

6 Chen BJ，Cui X，Sempowski GD，et al.Growth hormone accelerates immune recovery following allogeneic T-cells-depleted bone marrow transplantation in mice〔J〕.Exp Hematol，2003;31(10):953-8.

7 Hartwig M，Steinmann G.On a causal mechanism of chronic thymic involution in man〔J〕.Mech Ageing Dev，1994;75(2):151-6.

8 Anderson G，Jenkinson EJ.Lymphostromal interactions in thymic development and function〔J〕.Nat Rev lmmunol，2001;1(1):31-40.

9 Aspinall R，Andrew D.Age-associated thymic atrophy is not associated With a deficiency in the CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-thymocytes population〔J〕.Cells Immunol，2001;212(2):150-7.

10 Gui J，Zhu X，Dohkan J，et al.The aged thymus shows normal recruitment of lymphohematopoietic progenitors but has defects in thymic epithelial cells〔J〕.Int Immunol，2007;19(10):1201-11.

11 Schwarz BA，Sambandam A，Maillard I，et al.Selective thymus settling regulated by cytokine and chemokine receptors〔J〕.J Immunol，2007;178(4):2008-17.

12 Schorpp M，Hofmann M，Dear TN，et al.Characterization of mouse and human nude genes〔J〕.Immunogenetics，1997;46(6):509-15.

13 Wei Q，Condie BG.A focused in situ hybridization screen identifies candidate transcriptional regulators of thymic epithelial cell development and function〔J〕.PLoS One，2011;6(11):e26795.

14 Guo J，Feng Y，Barnes P，et al.Deletion of FoxN1 in the thymic medullary epithelium reduces peripheral T cell responses to infection and mimics changes of aging〔J〕.PLoS One，2012;7(4):e34681.

15 Sun L，Guo J，Brown R，et al.Declining expression of a single epithelial cell-autonomous gene accelerates age-related thymic involution〔J〕.Aging Cell，2010;9(3):347-57.

16 Mori K，Itoi M，Tsukamoto N，et al.Foxn1 is essential for vascularization of the murine thymus anlage〔J〕.Cell Immunol，2010;260(2):66-9.

17 Chen L，Xiao S，Manley NR.Foxn1 is required to maintain the postnatal thymic microenvironment in a dosage-sensitive manner〔J〕.Blood，2009;113(3):567-74.

18 Soza-Ried C，Bleul CC，Schorpp M，et al.Maintenance of thymic epithelial phenotype requires extrinsic signals in mouse and zebra fish〔J〕.J Immunol，2008;181(8):5272-7.