陳 怡 萬(wàn)建新 吳可貴 許昌聲 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,福建 福州 350005)
目前慢性腎臟病(CKD)最主要的并發(fā)癥也是最重要的死亡原因就是心血管疾病,是CKD治療中艱巨的難題〔1〕。過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體(PPARs)及其配體能提高組織對(duì)胰島素的敏感性,用于治療糖尿病腎病(DN),并且能降低血壓、調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥等〔2〕。另外,PPARs及其配體還具有更為廣泛的心血管保護(hù)作用,通過改善胰島素抵抗、糾正脂質(zhì)代謝紊亂、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移,從而改善心血管的病理性重構(gòu),可能在代謝綜合征及其并發(fā)的心血管損害中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。羅格列酮是過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體γ(PPAR-γ)激動(dòng)劑,在臨床上已用于治療糖尿病,但最近Nissen等〔3〕發(fā)表了一項(xiàng)有關(guān)羅格列酮的最新薈萃分析結(jié)果,表明羅格列酮可顯著增加患者心肌梗死危險(xiǎn),結(jié)果提示羅格列酮有不利的獲益風(fēng)險(xiǎn)比,羅格列酮的安全性問題凸顯出來(lái),但目前尚無(wú)定論。而我們前期的研究表明羅格列酮可改善慢性腎衰竭大鼠左心室肥厚〔4〕,本研究目的在于觀察不同劑量的羅格列酮對(duì)腎大部切除大鼠心肌單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響,研究羅格列酮對(duì)慢性腎衰竭大鼠心臟保護(hù)作用的機(jī)制,為羅格列酮對(duì)CKD患者心血管并發(fā)癥的防治提供一定的理論依據(jù)。
1.1 藥品和試劑 羅格列酮(文迪雅)由葛蘭素史克公司生產(chǎn)。由北京中山生物試劑公司購(gòu)買免疫組化試劑盒及各抗體。由北京北方生物技術(shù)研究所購(gòu)買放射免疫檢測(cè)試劑盒。由Fermentas公司購(gòu)買逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒,由TaKaRa生物工程有限公司購(gòu)買Premix Taq酶。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠32只(購(gòu)買自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量(220±20)g。分為兩大組,假手術(shù)組(n=8)和腎大部切除組(n=24)。手術(shù)后3 d再將存活的腎大部切除手術(shù)組大鼠24只隨機(jī)分成3組,腎大部切除組(NX組);腎大部切除加小劑量羅格列酮治療組(XL組);腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組(DL組),每組8只。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 給藥 XL組予羅格列酮5 mg·kg-1·d-1灌胃;DL組,予羅格列酮15 mg·kg-1·d-1灌胃。假手術(shù)組和腎大部切除組每日予等量自來(lái)水灌胃。
1.3.2 慢性腎衰竭大鼠模型(腎大部切除大鼠)的建立 按照本課題組前期成功制模經(jīng)驗(yàn)建立動(dòng)物模型及假手術(shù)組〔4〕。
1.3.3 標(biāo)本處理 喂養(yǎng)8 w后以斷頭法處死動(dòng)物,開胸取心臟,沿房室環(huán)剪去心房及右心室游離壁,取部分左心室左冠狀面中部心肌組織放入10%中性甲醛液中固定保存用于制作石蠟切片,其余心肌組織放入-70℃液氮中保存。
1.3.4 放射免疫檢測(cè) 血清血管緊張素Ⅱ(A2)的檢測(cè)采用放射免疫方法。
1.3.5 心臟病理檢查 取心肌組織蠟塊切片后(4 μm)行HE染色,光鏡下觀察心肌的病理變化并攝片。
1.3.6 免疫組化 心肌組織MCP-1采用SP法免疫組化染色。一抗為山羊抗鼠MCP-1多克隆抗體,滴度為1∶100。按試劑盒說(shuō)明書操作,以PBS代替一抗作空白對(duì)照。鏡下觀察細(xì)胞以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性信號(hào)。由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像,利用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,測(cè)定該區(qū)域面積的平均積分光密度值(OD值),平均每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)選擇6個(gè)視野。
1.3.7 RT-PCR 按Trizol試劑說(shuō)明提取心肌組織總RNA。以2 μg mRNA為模板,進(jìn)行 RT-PCR分析,反轉(zhuǎn)錄及 PCR方法,參見試劑盒說(shuō)明。所用引物序列:TGF-β1上游引物為5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3',下游引物為 5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物 298 bp。內(nèi)參照為GAPDH,其上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3';下游引物為:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物452 bp。PCR反應(yīng)體系總體積206 μl。TGF-β1 PCR反應(yīng)條件為 94℃變性5 min;94℃ 30 s,58℃45 s,72℃ 1 min,循環(huán)32 次;72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min,紫外燈下拍照,以White/Ultraviolet Transilluminator系統(tǒng)軟件分析圖像,目標(biāo)條帶與內(nèi)參照光密度的比為mRNA表達(dá)強(qiáng)度。
2.1 羅格列酮對(duì)大鼠血清A2的影響 術(shù)后8 w,與假手術(shù)組相比,各腎大部切除手術(shù)組大鼠血清A2水平均顯著升高(P<0.01)。與腎大部切除組相比,各羅格列酮治療組血清A2水平降低均有顯著性差異(P<0.01)。見表1。
2.2 心臟病理改變 術(shù)后8 w,HE染色顯示NX組心肌組織嚴(yán)重受損:肌纖維排列紊亂,大量心肌纖維斷裂,甚至出現(xiàn)肌原纖維溶解,心肌橫紋基本消失,廣泛的心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫和空泡變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散,細(xì)胞間隙增大;假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)較正常,肌纖維排列比較整齊有序,心肌橫紋清晰,細(xì)胞大小、形態(tài)正常,細(xì)胞質(zhì)染色均勻,細(xì)胞核大小正常,細(xì)胞間隙正常,而DL組部分逆轉(zhuǎn)其病理?yè)p害。見圖1。
圖1 各組大鼠心肌HE染色(×100)
2.3 心肌組織MCP-1的表達(dá) 術(shù)后8 w,假手術(shù)組心肌組織內(nèi)幾乎未見MCP-1表達(dá),NX組在心肌細(xì)胞內(nèi)可見較多MCP-1表達(dá)(P<0.01)。與NX組相比,各羅格列酮治療組心肌細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)有所降低,以DL組的差異有顯著性(P<0.01)。見表1、圖2。
圖2 各組大鼠心肌MCP-1表達(dá)(免疫組化,×200)
2.4 心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá) 術(shù)后8 w,與假手術(shù)組相比,各腎大部切除手術(shù)組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與腎大部切除組相比,各羅格列酮治療組心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)有所降低,以腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組的差異有顯著性 (P<0.01)。見表1、圖 3。
表1 羅格列酮對(duì)大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s,n=8)
表1 羅格列酮對(duì)大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s,n=8)
與NX組比較:1)P<0.01,2)P<0.05;與XL組比較;3)P<0.05
組別 A2(pg/ml) MCP-1 TGF-β1/GAPDH假手術(shù)組713.59±160.781) 0.006 3±0.002 31) 0.076±0.0231)NX組 2 022.21±487.69 0.139 4±0.016 4 0.311±0.127 XL組 1 189.62±215.222)0.081 3±0.010 11)2) 0.109±0.0342)DL組 854.05±215.221)0.061 7±0.013 81)3)0.063±0.0321)3)
CKD患者是心血管疾病的高危人群,可導(dǎo)致心腦血管疾病的高發(fā)病率和高病死率。近年來(lái)的研究提示羅格列酮能抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖〔5〕。曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮能抑制A2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的增加以及骨骼肌肌動(dòng)蛋白、心鈉肽基因表達(dá)的上調(diào);也能抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的兩種動(dòng)物模型的心臟體重比增加、室壁厚度增加及心肌細(xì)胞直徑增加〔6〕。但尚無(wú)有關(guān)羅格列酮對(duì)慢性腎臟病的心血管并發(fā)癥的研究。我們的前期研究表明:羅格列酮能改善慢性腎衰竭大鼠的高血壓,減少蛋白尿、降低血BUN、Scr,改善腎組織的病變,呈劑量依賴性的腎臟保護(hù)作用。同時(shí)羅格列酮可改善其左心室肥厚及抑制心肌組織膠原纖維沉積、減輕心肌組織纖維化,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有關(guān)〔4〕。
心肌纖維化是指由于各種因素致心肌間質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)和含量的改變,使心肌僵硬度增加、導(dǎo)致心室收縮和舒張功能改變、冠狀動(dòng)脈硬化,最終導(dǎo)致高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、心源性猝死等多種心血管疾病,因此,防止甚至進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為目前心血管疾病防治的重要課題〔7〕。在心肌纖維化的發(fā)展過程中,細(xì)胞因子是重要的參與因素,TGF-β和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等均參與心肌細(xì)胞膠原代謝,是最后導(dǎo)致心肌纖維化的一種中介物〔8〕。TGF-β在心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生及遷移、膠原網(wǎng)架改建中具有重要作用。在心臟心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中均有TGF-β表達(dá)。病理性增多的TGF-β可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖、纖維連接蛋白和各種膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì),加速心肌纖維化。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TGF-β對(duì)心肌細(xì)胞的效應(yīng)完全類似于慢性左心室心肌纖維化、肥厚、衰竭、重構(gòu)的病理生理過程。同時(shí),在心肌纖維化的發(fā)展過程中,A2的水平與TGF-β的表達(dá)高度相關(guān),A2可激活Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,刺激TGF-β病理性增高,促進(jìn)纖連蛋白及I、Ⅲ型膠原的合成,導(dǎo)致心肌纖維化進(jìn)展〔9〕。已有報(bào)道,A2的多種生物學(xué)效應(yīng)與下調(diào) PPARs相關(guān)〔10〕。本研究推測(cè)羅格列酮對(duì)腎大部切除術(shù)大鼠心臟保護(hù)作用可能與下調(diào)A2,抑制大鼠心肌組織TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。
MCP-1是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要因子,可促進(jìn)單核細(xì)胞的分化、聚集到炎癥部位、增加滲出,還能夠增加巨噬細(xì)胞超氧負(fù)離子的產(chǎn)生并誘發(fā)溶酶體酶的釋放,從而加重心肌缺血再灌注損傷。前壁心肌梗死小鼠(結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈)建模4 w后,心肌MCP-1 mRNA的表達(dá)增加;而在建模前3 d和建模后14 d,予變異的MCP-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠以后,前壁心肌梗死小鼠的MCP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被阻斷,其4 w存活率明顯提高,左心室擴(kuò)張減輕、心肌纖維化改善、巨噬細(xì)胞聚集減少、心肌TNF-α的表達(dá)減輕。提示MCP-1表達(dá)的激活不利于心肌梗死后心室重構(gòu)的改善,可導(dǎo)致慢性心衰竭〔11〕。另外,體外實(shí)驗(yàn)提示,羅格列酮可呈濃度依賴的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC-12)中由A2所誘導(dǎo)的MCP-1的表達(dá)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)推測(cè),羅格列酮下調(diào)A2,抑制大鼠心肌內(nèi)MCP-1的過度表達(dá)從而對(duì)腎大部切除大鼠心臟起到保護(hù)作用。
近年來(lái),有關(guān)羅格列酮的心臟安全性問題爭(zhēng)論激烈,但尚無(wú)定論。長(zhǎng)達(dá)5年的RECORD研究,納入了約4 500例糖尿病患者,結(jié)果顯示,與二甲雙胍或磺脲類相比,羅格列酮并不增加總體心血管住院或心血管死亡風(fēng)險(xiǎn),在心肌梗死、卒中或任何類型死亡的次要終點(diǎn)方面,兩組無(wú)顯著差異〔13〕。RECORD研究數(shù)據(jù)清楚地表明,羅格列酮與活性對(duì)照藥物具有相當(dāng)?shù)男难馨踩浴?型糖尿病旁路血管成形血運(yùn)重建研究(BARI 2D)的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論:在經(jīng)證實(shí)的冠狀動(dòng)脈疾病患者中,胰島素增敏劑羅格列酮與胰島素供給療法相比,并不增加主要的復(fù)合終點(diǎn)事件(死亡或主要心血管事件)〔14〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示梗死心肌重構(gòu)過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)上調(diào),細(xì)胞間基質(zhì)纖連蛋白(FN)被降解;激活PPAR-γ可能通過抑制MMP-9的表達(dá),減輕FN的降解,從而改善心肌重塑〔15〕。我們的研究也提示通過羅格列酮的干預(yù),腎大部切除大鼠的左心室肥厚得到改善。我們既往的研究提示〔16,17〕,羅格列酮可保護(hù)腎功能、延緩腎臟病變進(jìn)展。我們推測(cè),由于慢性腎衰竭的進(jìn)展得到延緩,腎大部切除大鼠左心室肥厚的進(jìn)展也得已延緩。同時(shí),羅格列酮可降低慢性腎衰竭大鼠腎性高血壓,下調(diào)A2,抑制心肌組織MCP-1和TGF-β1的表達(dá),改善心肌組織中膠原纖維的沉積、減輕心肌纖維化,改善其左心室病理性重構(gòu),從而對(duì)慢性腎衰竭大鼠的心臟起到保護(hù)作用。
1 鄭法雷,章友康,陳香美,等.腎臟病臨床與進(jìn)展〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社,2005:278-87.
2 Guan Y.PPAR family and its relationship to renal complications of the metabolic syndrome〔J〕.J Am Soc Nephrol,2004;15(16):2801-15.
3 Nissen SE,Wolski K.Rosiglitazone revisited:an updated meta-analysis of risk for myocardial infarction and cardiovascular mortality〔J〕.Arch Intern Med,2010;170(14):1191-201.
4 陳 怡,萬(wàn)建新,吳可貴,等.羅格列酮改善腎大部切除大鼠左心室肥厚〔J〕.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2011;19(12):989-94.
5 Mughal RS,Warburton P,O'Regan DJ,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma-independent effects of thiazolidinediones on human cardiac myofibroblast function〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2009;36(5-6):478-86.
6 Sakai S,Miyauchi T,Trukayama TY,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activities inhibit endothelin-1 related cardiac hypertrophy in rats〔J〕.Clin Sci(London),2002;103(s48):16-20.
7 Lammey ML,Baskin GB,Gigliotti AP,et al.Interstitial myocardial fibrosis in a captive chimpanzee(Pan troglodytes)population〔J〕.Comp Med,2008;58(4):389-94.
8 Pierce CW,Tucci MA,Lindley S,et al.Connective tissue growth factor(ctgf)expression in the tenosynovium of patients with carpal tunnel syndrome-biomed 2009〔J〕.Biomed Sci Instrum,2009;45(1):30-5.
9 黃 俊,覃國(guó)輝,馬業(yè)新,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1及其胞內(nèi)信號(hào)通路SMADs在大鼠心肌肥厚中的作用〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,2004;20(9):1601-4.
10 Kota BP,Huang TH,Roufogalis BD.An overview on biological mechanisms of PPARs〔J〕.Pharmacol Res,2005;51(2):85-94.
11 Hayashidani S,Tsutsui H,Shiomi T,et al.Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates left ventricular remodeling and failure after experimental myocardial infarction〔J〕.Circulation,2003;108(17):2134-40.
12 李春暉,譚茗月,張新超.激活過氧化物酶增殖物激活受體對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化因子-1表達(dá)的影響〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2006;25(9):664-7.
13 Home PD,Pocock SJ,Beck-Nielsen H,et al.Rosiglitazone evaluated for cardiovascular outcomes in oral agent combination therapy for type 2 diabetes(RECORD):a multicentre,randomised,open-label trial〔J〕.Lancet,2009;373(9681):2125-35.
14 The BARI 2D Study Group.A Randomized trial of therapies for type 2 diabetes and coronary artery disease〔J〕.NEJM,2009;360(24):2503-15.
15 楊大春,馬雙陶,楊永健,等.激活PPAR-γ對(duì)梗死心肌MMP-9及纖連蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,2010;26(11):2130-5.
16 陳 怡,萬(wàn)建新,吳可貴,等.羅格列酮減輕大鼠殘單核細(xì)胞趨化蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 的表達(dá)〔J〕. 高血壓雜志,2008;16(3):243-8.
17 陳 怡,萬(wàn)建新,吳可貴,等.羅格列酮對(duì)腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響及機(jī)制〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008;5(5):385-8.