陳 凰 吳 嚴(yán) 徐學(xué)剛 李遠(yuǎn)宏 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽100011)

隨著大氣臭氧層的破壞，人們戶外活動的增多，皮膚接受更多的紫外線(Ultraviolet，UV)輻射。UVA(320～340 nm)對皮膚的穿透能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于UVB(290～320 nm)，通常引起皮膚真皮組織中的膠原及彈力纖維的降解，是皮膚衰老的重要原因;UVA還可以介導(dǎo)皮膚光敏反應(yīng)的發(fā)生［1］，抑制皮膚的免疫功能［2］，甚至促進(jìn)皮膚腫瘤的形成［3］。我們以體外培養(yǎng)的第四代人體成纖維細(xì)胞作為UVA光源的靶細(xì)胞，觀察不同UVA輻射劑量及輻射后不同時間點細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、增殖活性和上清液中IL-1α、IL-1β、IL-6蛋白水平的變化，探討 UVA輻射對人體成纖維細(xì)胞的光損傷作用及炎性因子在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DS培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清);胰蛋白酶(Hyclone，日本);培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(labserv，美國);ELISA試劑盒(R＆D，美國);噻唑藍(lán)(MTT);SSA-01型UVA輻射儀(Sigma公司，上海);550型酶標(biāo)儀(Bio-Ran Laboratories Inc．，Hercules，加拿大);二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16，德國);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 取健康人包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，用含雙抗(青霉素100 000 U/L、鏈霉素100 mg/L)的PBS緩沖液漂洗3次，盡量剔除皮下脂肪組織，剪成 0．5 cm×0．5 cm的皮片，加入0.25%的胰蛋白酶4℃消化過夜。次日分離真表皮，將真皮部分剪碎后加入適量0．25%的胰蛋白酶37℃消化5分鐘，加入DS培養(yǎng)基終止消化，200目尼龍網(wǎng)過濾，過濾后的細(xì)胞1 000 r/min離心5分鐘，棄上清，加入適量DS培養(yǎng)基接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞貼壁生長融合達(dá)80%，用0．25%的胰蛋白酶1∶2消化傳代，取第四代對數(shù)生長期細(xì)胞用于進(jìn)一步的實驗。

1．2．2 實驗分組 將80%融合狀態(tài)的細(xì)胞用DS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104ml－1，定量接種于96孔板和6孔板。將細(xì)胞分為空白對照組、低劑量UVA輻射組(1 J/cm2)、中劑量UVA輻射組(5 J/cm2)及高劑量UVA輻射組(10 J/cm2)。

1．2．3 UVA輻射 接種于培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長達(dá)80%融合時予UVA輻射，輻射前棄去各孔培養(yǎng)液，PBS清洗2遍后加入適量PBS覆蓋，調(diào)整UVA輻射儀的參數(shù)，照完光后棄覆蓋液，向各檢測孔中加入DS培養(yǎng)基，置二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1．2．4 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 于輻射前及輻射后6、24、48、72小時觀察6孔板中各組細(xì)胞形態(tài)。

1．2．5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞增殖活性 輻射后6、24、48、72小時向96孔板的待測細(xì)胞中加入20 μl濃度為5 mg/ml的 MTT，37℃孵育4小時后棄上清，加入150 μl DMSO，震蕩10分鐘，直到紫藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取OD值，調(diào)零孔調(diào)零，每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)三次。計算細(xì)胞增殖率=(輻射組OD值－調(diào)零孔OD值)/(空白對照組OD值－調(diào)零孔OD值)×100%。

1．2．6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞因子分泌量 輻射后6、24、48、72小時收集6孔板中細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照說明書操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取OD值，調(diào)零孔調(diào)零。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析方法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 未經(jīng)輻射處理的成纖維細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞輪廓清楚折光好，排列似放射狀。1 J/cm2的UVA處理后6小時可見少量漂浮于培養(yǎng)液中折光度增加的損傷細(xì)胞，其余時間點細(xì)胞無明顯形態(tài)學(xué)改變。5 J/cm2的UVA輻射后6小時細(xì)胞腫脹，鄰近細(xì)胞分離;24小時發(fā)生上述改變的細(xì)胞數(shù)量減少;48小時進(jìn)一步減少;72小時基本未觀察到受損傷的細(xì)胞，可見新生漩渦排列的成纖維細(xì)胞。10 J/cm2的UVA處理組于6小時絕大部分細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分離，細(xì)胞體中心部分形態(tài)不規(guī)則、皺縮，胞漿濃縮，細(xì)胞突起缺失，24、48、72小時凋亡、壞死的細(xì)胞脫落，上述損傷性改變呈逐漸減輕趨勢，結(jié)果顯示見圖1。

2．2 細(xì)胞增殖率 與空白對照組相比，1 J/cm2的UVA輻射后所有時間點及5 J/cm2的UVA輻射后6、24小時細(xì)胞增殖活性無明顯改變(P＞0．05);5 J/cm2UVA輻射后48小時增殖率顯著下降(P＜0.05)，72小時恢復(fù)(P＞0．05)。10 J/cm2UVA 輻射后所有時間點細(xì)胞增殖活性均明顯低于空白對照(P＜0．05)，6小時開始下降，24小時下降達(dá)高峰，48、72小時逐漸回升。10 J/cm2UVA輻射后24、48小時的增殖率亦顯著低于1 J/cm2及5 J/cm2(P＜0．05)，結(jié)果顯示見表 1。

2．3 細(xì)胞因子測定

圖1 長波紫外線輻射后人體成纖維細(xì)胞形態(tài)變化(10×20)Fig．1 The alterations of cellular morphology after UVA irradiation(10×20)

2．3．1 IL-1α 蛋白 各劑量UVA輻射后(1 J/cm2、5 J/cm2、10 J/cm2)6小時IL-1α蛋白水平顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而24、48、72小時與空白對照組比較無顯著差異(P＞0．05)。空白組、1 J/cm2UVA輻射后24小時IL-1α蛋白水平顯著高于相應(yīng)組內(nèi)6、48、72 小時水平(P ＜ 0．05);5 J/cm2、10 J/cm2UVA輻射后6、24小時 IL-1α蛋白水平亦顯著高于相應(yīng)組內(nèi)48、72小時水平(P＜0．05)，結(jié)果顯示見表2。

2．3．2 IL-1β蛋白 1 J/cm2UVA輻射后各時間點IL-1β蛋白水平均與空白對照組比較無顯著差異(P ＞0．05);而 5 J/cm2、10 J/cm2UVA 輻射后各時間點IL-1β蛋白水平均顯著高于空白對照組(P＜0.05)。10 J/cm2UVA輻射后各時間點蛋白水平均高于1J/cm2UVA組。各組內(nèi)IL-1β蛋白水平未隨著時間變化而變化，結(jié)果顯示見表3。

表1 各劑量組UVA輻射后不同時間點成纖維細(xì)胞的增殖率(±s，n=6，%)Tab．1 Cellular proliferation rates at different time point after UVA irradiation(±s，n=6，%)

表1 各劑量組UVA輻射后不同時間點成纖維細(xì)胞的增殖率(±s，n=6，%)Tab．1 Cellular proliferation rates at different time point after UVA irradiation(±s，n=6，%)

Note:1)P ＜0．05 vs blank group of corresponding time point;2)P ＜0．05 vs 1 J/cm2UVA group of corresponding time point;3)P ＜0．05 vs 5 J/cm2 UVA group of corresponding time point;4)P ＜0．05 vs 6，48，72 h of corresponding group．

Groups 6 h 24 h 48 h 72 h Blank 100．00 ±10．78 100．00 ±14．97 100．00 ±13．63 99．95 ±12．23 1 J/cm2 92．57 ±24．54 91．4 ±14．39 90．87 ±20．94 92．92 ±19．58 5 J/cm2 88．82 ±27．05 97．6 ±25．86 85．22 ±11．981) 89．74 ±29．06 10 J/cm2 78．01 ±12．741) 65．87 ±20．111)2)3)4) 71．96 ±11．481)2)3) 80．64 ±36．121)

表2 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-1α蛋白水平(±s，n=3，pg/ml)Tab．2 The level of IL-1α at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/ml)

表2 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-1α蛋白水平(±s，n=3，pg/ml)Tab．2 The level of IL-1α at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/ml)

Note:1)P ＜0．05 vs blank group of corresponding time point;2)P ＜0．05 vs 6，48，72 h of corresponding group;3)P ＜0．05 vs 48，72 h of corresponding group．

Groups 6 h 24 h 48 h 72 h Blank 48．51 ±6．20 63．34 ±5．082) 50．07 ±3．91 54．61 ±3．09 1 J/cm2 57．37 ±3．661) 64．57 ±2．852) 54．20 ±5．39 48．82 ±1．36 5 J/cm2 60．27 ±3．381)3) 60．81 ±6．583) 54．79 ±2．97 51．69 ±1．82 10 J/cm2 58．39 ±0．671)3) 60．13 ±3．083) 51．77 ±1．77 49．85 ±5．73

表3 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-1β蛋白水平(x±s，n=3，pg/L)Tab．3 The level of IL-1β at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/L)

表3 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-1β蛋白水平(x±s，n=3，pg/L)Tab．3 The level of IL-1β at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/L)

Note:1)P ＜0．05 vs blank group of corresponding time point;2)P ＜0．05 vs 1 J/cm2UVA group of corresponding time point．

Groups 6 h 24 h 48 h 72 h Blank 1 023．25 ±86．40 1 058．45 ±37．30 1 109．66 ±48．13 1 045．55 ±48．18 1 J/cm2 1 103．75 ±81．11 1 132．13 ±45．69 1 202．72 ±83．81 1 113．67 ±84．44 5 J/cm2 1 213．62 ±90．001) 1 229．16 ±39．911) 1 265．71 ±5．861) 1 203．49 ±56．601)10 J/cm2 1 294．37 ±92．511)2) 1 270．98 ±60．221)2) 1 311．25 ±73．171)2) 1 236．76 ±56．491)2)

表4 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-6蛋白水平(±s，n=3，pg/ml)Tab．4 The level of IL-6 at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/ml)

表4 各劑量組UVA輻射后不同時間點IL-6蛋白水平(±s，n=3，pg/ml)Tab．4 The level of IL-6 at different time point after UVA irradiation(±s，n=3，pg/ml)

Note:1)P ＜0．05 vs blank group of corresponding time point;2)P ＜0．05 vs 1 J/cm2UVA group of corresponding time point;3)P ＜0．05 vs 5 J/cm2 UVA group of corresponding time point;4)P ＜0．05 vs 24，48，72 h of corresponding group;5)P ＜0．05 vs 48，72 h of corresponding group．

Groups 6 h 24 h 48 h 72 h Blank 1 J/cm2 5 J/cm2 10 J/cm2 160．45 ±7．194)182．56 ±5．201)4)179．68 ±6．701)4)197．81 ±6．371)2)3)4)196．01 ±5．39 195．55 ±1．86 207．60 ±7．041)2)240．62 ±1．421)2)3)5)190．13 ±4．01 193．74 ±2．49 203．72 ±4．051)2)212．150 ±4．371)2)3)195．09 ±1．78 197．83 ±3．22 201．48 ±4．00 215．65 ±3．781)2)3)

2．3．3 IL-6蛋白 各UVA輻射組6小時IL-6蛋白水平均顯著高于空白對照組;1 J/cm2UVA組其余各時間點IL-6蛋白水平與空白對照組比較無顯著差異(P＞0．05);5 J/cm2UVA持續(xù)高水平至48小時;10 J/cm2UVA持續(xù)高水平至72小時，且IL-6蛋白水平在各時間點均高于1 J/cm2UVA組、5 J/cm2UVA組(P＜0．05)。空白對照組和各UVA輻射組6小時時蛋白水平均顯著低于相應(yīng)組內(nèi)其它時間點水平。10 J/cm2UVA輻射后24小時達(dá)峰值，顯著高于其它時間點，結(jié)果顯示見表4。

3 討論

空白對照組的成纖維細(xì)胞IL-1α、IL-6蛋白水平分別在培養(yǎng)后24小時達(dá)峰值，之后IL-1α下降、IL-6維持在高水平;IL-1β則無上述高峰過程。而各劑量UVA輻射組的IL-1α、IL-6蛋白水平在24小時也處于峰值，故UVA輻射成纖維細(xì)胞后IL-1α、IL-6蛋白水平的變化是否確與UVA有關(guān)需進(jìn)一步明確。結(jié)果顯示，各UVA輻射組IL-1α蛋白水平在24小時均與空白對照組無差別，而中、高劑量UVA輻射組IL-6蛋白水平24小時時顯著高于此時的空白對照組。故我們考慮中、高劑量UVA輻射后24小時IL-6蛋白水平的升高與UVA輻射密切相關(guān)，而各劑量UVA輻射后24小時IL-1α的升高可能與樣本量小有關(guān)。

低劑量(1 J/cm2)UVA輻射后6小時未引起明顯的細(xì)胞形態(tài)損傷及細(xì)胞增殖活性變化，但此時IL-1α、IL-6蛋白水平顯著高于空白對照，其余觀察點則與空白對照比較無差異。故雖然低劑量UVA輻射未引起明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及增殖活性變化，但仍可在輻射后6小時誘導(dǎo)IL-1α、IL-6一過性分泌?？梢娙梭w成纖維細(xì)胞能在短時間內(nèi)(6小時)對低劑量UVA刺激做出反應(yīng)，而這種反應(yīng)可能是應(yīng)激性的，并不足以引起細(xì)胞損傷。

中劑量(5 J/cm2)UVA輻射6小時可引起明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，雖然細(xì)胞增殖率無明顯變化但I(xiàn)L-1α、IL-1β、IL-6顯著升高，提示中劑量 UVA 輻射早期即對人體成纖維細(xì)胞產(chǎn)生損傷。輻射后24小時細(xì)胞形態(tài)損傷已開始少量恢復(fù)，但由于此時細(xì)胞線粒體功能更加活躍，將更多的外源性MTT經(jīng)琥珀酸脫氫酶還原成了不可溶性的紫色結(jié)晶物［4］，因此輻射后24小時檢測的細(xì)胞增殖率反常性高于此時間點空白對照組及低劑量UVA組。輻射后48小時的大部分細(xì)胞形態(tài)已恢復(fù)，但細(xì)胞增殖率低于空白對照組，而72小時時細(xì)胞形態(tài)及增殖率均恢復(fù)。IL-1α蛋白水平觀察至24小時時即已與空白對照組無差別，IL-6至72小時時無差別，而IL-1β蛋白水平至72小時仍顯著高于空白對照組。上述大部分指標(biāo)的結(jié)果指向中劑量的UVA輻射引起人體成纖維細(xì)胞的損傷的時間可能在輻射后6小時，這種損傷可能持續(xù)至48～72小時方可恢復(fù)。

高劑量(10 J/cm2)的UVA誘導(dǎo)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)直接導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死，使細(xì)胞形態(tài)明顯異于正常細(xì)胞、增殖活性明顯低于各觀察點空白對照組。IL-1α、IL-1β、IL-6均在輻射后6小時顯著升高，IL-1α在24小時恢復(fù)至空白對照組水平，IL-1β、IL-6持續(xù)高水平至72小時。故高劑量的UVA對人體成纖維細(xì)胞的損傷可能持續(xù)至72小時，甚至在72小時后的更長時間內(nèi)。

UVA輻射可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(Reactive oxygen speecies，ROS)，ROS攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞及DNA的光損傷。ROS能夠扮演與生長因子或細(xì)胞因子相似的配體角色，激活I(lǐng)L-1受體［5］，以自分泌的方式誘導(dǎo)IL-1α、IL-1β的合成、釋放，促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成、分泌 IL-6［6，7］，另外，ROS 是 NF-κB 活化的決定性調(diào)節(jié)因子，NF-κB活化后，上調(diào) IL-1、IL-6 mRNA的表達(dá)。故IL-1和IL-6的升高可間接反應(yīng)UVA輻射細(xì)胞的損傷程度。IL-1和IL-6還可通過MAPK通路促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)的表達(dá)［8，9］，MMP 幾乎特異性降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起皮膚光老化，而皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚MMPs的主要來源，說明IL-1和IL-6可能參與人體成纖維細(xì)胞的光損傷過程。

我們的體外研究初步探討了不同劑量UVA輻射不同時間對人體成纖維細(xì)胞形態(tài)、增殖活性的影響及炎性因子的變化在其中的作用。UVA輻射引起的光損傷呈劑量依賴性，細(xì)胞自我修復(fù)呈時間依賴性。中、高劑量的UVA輻射對人體成纖維細(xì)胞形態(tài)、增殖活性有明顯的損傷作用，細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6可以間接反應(yīng)，甚至可能參與這種光損傷作用，但仍需進(jìn)一步的實驗證實IL-1α、IL-1β、IL-6在光損傷中的作用機(jī)制。

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