程 昉 湯建平 張曉宇 曾 郁 房星星 龔邦東

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海200065)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎和侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的全身性自身免疫病。RA滑膜組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，這些細(xì)胞由循環(huán)穿過(guò)血管內(nèi)皮外滲至炎癥關(guān)節(jié)的過(guò)程中趨化因子發(fā)揮重要作用。趨化因子分為CXC、CC、C、CX3C四類，它們通過(guò)與相應(yīng)受體相互作用調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移。CCL28，也稱黏膜相關(guān)上皮趨化因子(Mucosa-associated epithelial chemokine，MEC)，是近年發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子［1，2］。研究表明CCL28在銀屑病、哮喘病變組織中異常高表達(dá)［2，3］，提示它參與了炎癥性疾病的發(fā)生過(guò)程。本研究觀察RA患者外周血、滑液和滑膜組織中CCL28的表達(dá)情況，探討其在RA發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 44例RA患者來(lái)自同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和骨科住院患者，其中男11例，女33例，平均年齡(63±11)歲，臨床診斷均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫性疾病、感染和惡性腫瘤。正常對(duì)照組20例，均為健康體檢者，男4例，女16例，平均年齡(59±11)歲。兩組性別和年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。記錄RA患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，并計(jì)算疾病活動(dòng)性評(píng)分(Disease activity score in 28 joints，DAS28)，根據(jù)評(píng)分將患者分為非活動(dòng)期組(DAS28≤3.2)10例，活動(dòng)期組(DAS28＞3.2)34例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 外周靜脈血取自所有RA患者和正常對(duì)照者，滑液取自15例伴有膝關(guān)節(jié)積液的活動(dòng)期RA患者，抗凝，離心，收集血漿和滑液，-20℃保存待測(cè)。8例RA患者經(jīng)關(guān)節(jié)手術(shù)切取滑膜標(biāo)本，另取4例骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得受試者知情同意后取材。

1.2.2 血漿和滑液CCL28水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法。人CCL28 ELISA試劑盒購(gòu)自R＆D公司，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，用ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)測(cè)定450 nm處吸光值。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 采用EnVision二步法?；そM織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制備切片。切片脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3分鐘×3次，置于pH6.0檸檬酸鹽緩沖液微波高溫修復(fù)抗原，自然冷卻，PBS洗3次，置于Tris緩沖鹽溶液(TBS)中，3%過(guò)氧化氫室溫孵育20分鐘阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水漂洗，置于TBS中10分鐘，滴加兔抗人CCL28多克隆抗體(Gene-Tex公司，1∶500)37℃孵育1小時(shí)，PBS洗3次，加EnVision二抗(Dako公司)工作液37℃孵育30分鐘，PBS洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。鏡下細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)(符合正態(tài)分布和方差齊性)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RA患者與對(duì)照組血漿CCL28水平比較(±s)Tab．1 CCL28 levels in plasma of RA patients and healthy controls(±s)

表1 RA患者與對(duì)照組血漿CCL28水平比較(±s)Tab．1 CCL28 levels in plasma of RA patients and healthy controls(±s)

Note:Compared with the active RA group without joint effusion，1)P ＜0.01;compared with the control group，2)P ＜0.05.

Groups n CCL28(pg/ml)Active RA Joint effusion 15 1 400±3381)2)No joint effusion 19 1 107±264 Inactive RA 10 988±156 Healthy controls 20 1 151±235

2 結(jié)果

2.1 血漿CCL28水平 活動(dòng)期RA患者有關(guān)節(jié)積液組血漿CCL28水平高于無(wú)關(guān)節(jié)積液組(P＜0.01)和健康對(duì)照組(P＜0.05)，非活動(dòng)期RA組血漿CCL28水平與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 滑液CCL28水平 有關(guān)節(jié)積液的RA患者滑液CCL28水平為(2 724±359)pg/ml，顯著高于配對(duì)血漿CCL28水平(P＜0.001)，見圖1。

圖1 RA患者血漿與滑液CCL28水平比較Fig．1 CCL28 levels in plasma and synovial fluid of RA patients

圖2 滑膜組織中CCL28的表達(dá)(EnVision免疫組化染色)Fig．2 The expression of CCL28 in synovial tissues detected by immunohistochemistry(EnVision)

2.3 CCL28水平與RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系RA患者血漿或滑液CCL28水平在類風(fēng)濕因子(RF)陽(yáng)性組和陰性組、抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體陽(yáng)性組和陰性組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、DAS28評(píng)分、血沉、C反應(yīng)蛋白亦無(wú)相關(guān)性。

2.4 滑膜組織CCL28的表達(dá) RA患者的滑膜組織均表達(dá)CCL28，但骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜幾乎無(wú)CCL28表達(dá)，見圖2。CCL28表達(dá)于RA滑膜襯里層和襯里下層，陽(yáng)性細(xì)胞呈胞質(zhì)染色，為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)染色。

3 討論

CCL28是 2000年發(fā)現(xiàn)的 CC趨化因子，與CCL27同源性最強(qiáng)，約有40%的氨基酸相同［1］。CCL28廣泛表達(dá)于黏膜組織的上皮細(xì)胞，唾液腺、乳腺、結(jié)腸和直腸表達(dá)較豐富。CCR10和CCR3是CCL28的受體，CCL28可以招募表達(dá)CCR10的記憶性T淋巴細(xì)胞和IgA抗體分泌細(xì)胞，以及表達(dá)CCR3的嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)入相關(guān)組織［1，2，4］。研究表明CCL28參與黏膜免疫，具有廣譜抗微生物活性，與炎癥、感染、腫瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［2-7］。

RA滑液和滑膜組織表達(dá)多種趨化因子，它們誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞遷移至炎癥關(guān)節(jié)，還參與滑膜血管生成，在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。張艷莉等［8］報(bào)道 RA患者血中 CCL28水平升高，與血沉、RF呈正相關(guān)。本研究顯示無(wú)關(guān)節(jié)積液的RA患者血漿CCL28水平與對(duì)照組無(wú)差異，而有關(guān)節(jié)積液的患者血漿CCL28升高，其滑液CCL28更高，提示RA急性起病或復(fù)發(fā)(出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液)時(shí)外周血和滑液CCL28水平上調(diào);研究未發(fā)現(xiàn)CCL28水平與RA自身抗體及疾病活動(dòng)性指標(biāo)存在關(guān)聯(lián)，提示CCL28可能在關(guān)節(jié)局部發(fā)揮作用而不參與全身炎癥反應(yīng)，不能作為RA的臨床觀察指標(biāo)。Tsubaki等［9］采用免疫組化研究顯示CCL28表達(dá)在RA滑膜襯里層的巨噬細(xì)胞(A型滑膜細(xì)胞)。本研究的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)CCL28在骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中幾乎不表達(dá)，但在RA滑膜襯里層和襯里下層均有表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。雖然中性粒細(xì)胞在RA滑膜組織中的數(shù)量有限，但是它在RA滑液中非常豐富，因而可能是滑液CCL28的重要來(lái)源。以上研究中RA滑膜成纖維細(xì)胞(B型滑膜細(xì)胞)未見CCL28表達(dá)，但另有研究顯示該細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)表達(dá) CCL28基因和蛋白［10，11］，這可能與研究方法不同、微環(huán)境的改變有關(guān)。

RA患者滑液及滑膜組織中CCL28異常高表達(dá)，其原因可能與促炎細(xì)胞因子、缺氧有關(guān)。IL-1β和TNF-α在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)在黏膜上皮(氣道、結(jié)腸)IL-1β、TNF-α 可通過(guò)激活 NF-κB信號(hào)通路增加 CCL28 的產(chǎn)生［3，12］。此外，RA 滑膜增生導(dǎo)致慢性缺氧，研究顯示缺氧能上調(diào)某些細(xì)胞(RA滑膜成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞)CCL28 的表達(dá)［7，10］。CCL28在RA發(fā)病機(jī)制中的作用如何尚不清楚，推測(cè)CCL28可能通過(guò)與淋巴細(xì)胞上的受體CCR10結(jié)合介導(dǎo)外周血CCR10+T、B淋巴細(xì)胞遷移到炎癥關(guān)節(jié)。有意思的是，F(xiàn)acciabene等［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧誘導(dǎo)表達(dá)的CCL28能夠招募CCR10+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，Tregs繼而促進(jìn)腫瘤免疫耐受和血管生成。由于RA滑液中富含 Tregs［13］，因此CCL28與滑液 Tregs聚集和滑膜血管生成的關(guān)系值得進(jìn)一步探討。

本研究中RA患者伴有關(guān)節(jié)積液時(shí)外周血CCL28水平升高，滑液CCL28又高于外周血;CCL28表達(dá)在RA滑膜襯里層和襯里下層的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，而對(duì)照滑膜幾乎無(wú)表達(dá)，提示CCL28參與了RA的免疫病理過(guò)程。深入研究并揭示CCL28在RA發(fā)病中的潛在作用及機(jī)制將可能為靶向趨化因子和趨化因子受體治療RA提供新的靶點(diǎn)。

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