白福良 田 輝 牛澤杉 于引航 王文飛 周 兵 李德山

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物制藥教研室，哈爾濱150030)

白細胞介素15(IL-15)是1994年 Grabstein等［1］發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞因子，可由活化的單核-巨噬細胞、表皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生［2］。IL-15前體分子由162個氨基酸組成，先導序列較長為48個氨基酸殘基，成熟分子114個氨基酸殘基，分子量14～15 kD。IL-15具有類似IL-2的結(jié)構(gòu)和功能，可刺激CTLL細胞和PHA活化T細胞(CD4+和CD8+亞群)的增殖、誘導細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)和淋巴因子激活殺傷細胞(Lymphokine-activated killer cells，LAK)的產(chǎn)生［3，4］。

IL-15有廣泛的生物學活性，在人體多種組織細胞中，分布廣泛，在機體免疫/炎癥性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸疾病以及超敏反應的發(fā)病過程中起重要作用，而且IL-15是一個重要的抗腫瘤因子，在機體荷瘤狀態(tài)下具有免疫調(diào)節(jié)作用［5］。

本實驗利用pSUMO Vector原核表達載體，高效且可溶表達hIL-15蛋白。以往以非融合標簽的形式表達hIL-15需經(jīng)多步層析純化后才能達到較高純度的蛋白，操作步驟較繁瑣。本實驗克隆并以融合標簽的形式表達了hIL-15，其主要以可溶形式表達，并可以通過二步親和層析獲得較高純度的蛋白，由此方法得到的蛋白活性較好。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 菌株和細胞株 Trans2-Blue化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DH5α、Rosetta由本實驗室保存;HepG2和H22細胞株由本實驗室保存;B16-F10細胞株由廈門大學韓家淮實驗室饋贈。

1．1．2 克隆和表達載體 pMD18-T vector購自TaKaRa公司;pSUMO Vector由本實驗室保存。酶及生化試劑:TaqDNA聚合酶、BamHⅠ購自TaKaRa公司;T4 DNA Ligase、BsaⅠ限制性內(nèi)切酶購自New England BioLabs公司;SUMO蛋白酶由本實驗室保存。Reverse Transcriptase、RI、oligod(T)-18primer和Trizon購自Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;膠回收試劑盒購自QIAGEN公司。

1．1．3 引物設計與合成 由Invitrogen公司合成。構(gòu)建克隆 hIL-15引物:SenseprimerP1:5'-TGAGAATTTCGAAACCACA-3'下劃線為BsaⅠ切割位點;Antisense primer P2:5'-CG-TTAAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG-3'下劃線為BamHⅠ切割位點。

1．1．4 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重(20±1)g，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1．2 實驗方法

1．2．1 人外周血淋巴細胞的分離、mRNA的提取和cDNA的合成 使用常規(guī)方法分離人外周血淋巴細胞，Trizon試劑裂解淋巴細胞，酚氯仿(1∶3)進行抽提，得到mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1．2．2 rpSUMOhIL-15的表達載體的構(gòu)建 以合成cDNA為模板，以 P1、P2為引物進行 PCR，得到的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化Trans2-Blue化學感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，由生工生物工程(上海)有限公司進行測序。將測序后與GenBank公布的序列完全相同的質(zhì)粒使用BamHⅠ和 BsaⅠ進行酶切，連入 pSUMO Vector，轉(zhuǎn)化Trans2-Blue化學感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒并鑒定，構(gòu)建出rpSUMOhIL-15的表達載體。

1．2．3 工程菌的誘導表達 轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α，Rosetta)化學感受態(tài)細胞，經(jīng)過活化后轉(zhuǎn)接入500 ml培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)至OD600值為0．3～0．4 時加入終濃度為0．25 mmol/ml的 IPTG，37℃誘導4個小時后，離心、收集菌液。

1．2．4 rhIL-15的純化 取 rpSUMOhIL-15轉(zhuǎn)化菌大量誘導表達hIL-15，誘導后的菌體用Lysis buffer(10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)重懸后，加入溶菌酶至終濃度為1 g/L，冰上放置30分鐘后超聲破碎，12 000 r/min離心30分鐘，收集上清。上清液利用AKTA purifier 100系統(tǒng)經(jīng)過 His TrapTMFF crude親和層析，用Wash buffer(20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)洗去雜蛋白后，再用Elution buffer(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白。收集的融合蛋白脫鹽后，加入SUMO Protease和終濃度2 mmol/L的 DTT，30℃切割1小時，再經(jīng)Ni-NTA柱親和層析，收集流出液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1．2．5 高效液相色譜HPLC柱層析對目的蛋白的純度分析 將上述得到的rhIL-15成熟蛋白進行高效液相色譜HPLC柱層析，分析目的蛋白的純度。

1．2．6 rhIL-15成熟蛋白的生物活性分析 培養(yǎng)CTLL2細胞，調(diào)細胞濃度為1×105ml－1，加入 rhIL-15終濃度為100 ng/ml，設置對照組，觀察CTLL2細胞增殖情況。以CTLL2的增殖指數(shù)為1，MTT法測定其他組細胞的增殖指數(shù)。

常規(guī)分離人外周血單核細胞，用RPMI1640調(diào)細胞濃度為1×106ml－1，加入rhIL-15終濃度為100 ng/ml，同時設對照組。培養(yǎng)144小時誘生的LAK細胞作為效應細胞，HepG2和B16-F10細胞為靶細胞，同時設置對照組，設定效靶比 100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，每組設置3 個平行樣，MTT 法測定LAK細胞對HepG2和B16-F10細胞的殺傷活性。

1．2．7 昆明小鼠H22肝癌動物模型建立 將H22小鼠肝癌細胞于昆明小鼠腹腔接種，7天后斷頸處死小鼠。無菌條件下抽取腹水，稀釋成1×106ml－1，每只小鼠右側(cè)腹股溝皮下注入 100 μl。7 ～10天后皮下形成實體瘤。

2 結(jié)果

2．1 pMD18-T-IL-15的構(gòu)建和鑒定 以cDNA為模板，加入P1、P2 兩種引物，10 ×PCR buffer、rTaq酶和水進行PCR，擴增出一條大約500 bp的特異性目的條帶，與預期的492 bp大小相符，初步確認為hIL-15片段。對產(chǎn)物進行回收后，與pMD18-T-vector連接，轉(zhuǎn)化Trans2-Blue化學感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，構(gòu)建出rhpMD18-T-IL-15質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ進行雙酶切鑒定，得到約2 700 bp和500 bp的條帶，與預期的2 694 bp和492 bp目的條帶大小相符，如圖1所示:經(jīng)測序后，測序結(jié)果與Gene-Bank［7］上的序列完全一致，確定重組質(zhì)粒pMD18-TIL-15完全正確。

2．2 rpSUMO Vector-IL-15的構(gòu)建和鑒定 用BamHⅠ和BsaⅠ對重組質(zhì)粒pMD18-T-IL-15進行雙酶切，回收目的產(chǎn)物后與pSUMO Vector連接，轉(zhuǎn)化Trans2-Blue化學感受態(tài)細胞提取質(zhì)粒，構(gòu)建出重組pSUMOhIL-15質(zhì)粒。將挑取的單菌落采用菌液PCR鑒定目的基因是否連入pSUMO Vector中。對初步鑒定正確的單菌落提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BsaⅠ進行酶切鑒定，如圖2所示，得到約5 700 bp和500 bp的條帶，與預期的條帶大小相符。

2．3 目的蛋白的表達和純化 將重組質(zhì)粒rpSUMOhIL-15轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α，Rosetta)化學感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)接入 500 ml培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)至OD600值為0．3～0．4時進行誘導目的蛋白的表達。在37℃，IPTG濃度為0．25 mmol/L的條件下誘導表達，分別取未誘導和誘導時間分別為 2、2．5、3、3．5、4小時菌液的上清和沉淀于12%分離膠進行SDSPAGE分析，確定最佳的誘導時間為4小時，而且發(fā)現(xiàn)目的蛋白以融合蛋白的形式于上清中表達。

圖1 pMD18-T-IL-15的酶切鑒定Fig．1 Restriction enzyme analysis of pMD18-T-IL-15

收集的菌液經(jīng)過超聲破碎、過濾后加入到預先Washing buffer平衡好的親和層析柱中，使用AKAT purifier 100蛋白自動純化系統(tǒng)進行純化。經(jīng)過親和層析、Washing buffer除雜質(zhì)、Elusion buffer洗脫目的蛋白、目的蛋白脫鹽后得到較純的rpSUMOhIL-15蛋白。通過將陽性誘導菌株的表達蛋白薄層掃描圖與含空載體的誘導菌株的表達蛋白薄層掃描圖進行對比，可以得出融合蛋白表達量約占宿主細胞中總蛋白質(zhì)量的33%，已屬高效表達范疇。

圖2 pSUMO Vector-IL-15的PCR和酶切鑒定Fig．2 Restriction enzyme and PCR analysis of pSUMO Vector-IL-15

圖3 SDS-PAGE分析Fig．3 Assay by SDS-PAGE

上柱前、脫鹽后和SUMO蛋白酶切后的蛋白在15%分離膠進行SDS-PAGE分析，如圖3所示，從圖中可以看出已獲得成熟rhIL-15蛋白。

2．4 高效液相色譜HPLC柱層析分析目的蛋白的純度 將上述得到的rhIL-15成熟蛋白進行高效液相色譜HPLC柱層析，分析目的蛋白的純度，如圖4所示，可以看出目的蛋白的純度在95%以上，屬于高純度范疇。

圖4 高效液相色譜HPLC柱層析分析目的蛋白的純度Fig．4 Purity of purpose protein was analyzed by HPLC(High Performance Liquid Chromatography)

圖5 rhIL-15促進CTLL2增殖Fig．5 rhIL-15 stimulated proliferation of CTLL2 cells

2．5 rhIL-15成熟蛋白的活性檢測 濃度為1×105ml－1CTLL2細胞中加入終濃度為100 ng/ml rhIL-15，對照組分別加入轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒且采用同樣方法處理相同體積的洗脫液、相同體積的生理鹽水。培養(yǎng)24小時后，MTT法檢測細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與對照組相比(對照組增殖指數(shù)為1)，rhIL-15可以明顯刺激CTLL2細胞的增殖，維持CTLL2細胞的正常生長(P＜0．01)，結(jié)果如圖5所示。

圖6 rhIL-15活化的NK細胞對B16-F10和 HepG2細胞的殺傷效應Fig．6 NK cells activated by rhIL-15 against B16-F10 and HepG2cells

圖7 PBS和rhIL-15治療組荷瘤鼠模型腫瘤體積變化及均值比較Fig．7 Tumor growth of tumor-bearing mouse model treated with PBS or rhIL-15 and mean value of two groups tumor volume

rhIL-15誘生的LAK細胞作為效應細胞，HepG2細胞和B16-F10細胞為靶細胞，MTT法測定LAK細胞對HepG2和B16-F10細胞的殺傷作用。如圖6所示，與對照組相比較，rhIL-15誘生的LAK細胞對HepG2和B16-F10細胞具有顯著的殺傷作用(P＜0．01)。在效靶比為 100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1時，殺傷活性隨效靶比的下降而降低沒有經(jīng)過rhIL-15誘生的淋巴細胞對HepG2細胞和B16-F10細胞的殺傷活性很低。

2．6 rhIL-15對昆明小鼠H22肝癌動物模型的抑制荷瘤鼠腫瘤直徑達到5～8 mm開始治療，將實驗動物隨機分為2組，每組5只小鼠，分別靜脈注射50 μl PBS和rhIL-15(100 ng)每2天一次，連續(xù)治療4次，隔天測量一次腫瘤直徑，應用公式:V=4/3×π×r3，計算腫瘤體積(其中r表示腫瘤直徑的平均值)。如圖7所示，PBS治療組，治療前腫瘤平均體積為 614．3411 mm3，治療后平均體積為3 254．368 mm3，腫瘤體積顯著增加。rhIL-15治療組，治療前腫瘤平均體積為476．488 7 mm3，治療后平均體積為67．101 57 mm3，腫瘤體積明顯減小。

3 討論

近年來的研究表明SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點，以其作為分子伴侶可促進外源蛋白正確折疊，增強了融合蛋白的可溶性［8，9］。

本研究利用pSUMO Vector原核表達系統(tǒng)高效、可溶性地表達hIL-15蛋白，在最佳表達條件下，該載體表達人hIL-15蛋白，表達量達到了菌體總蛋白的33%，說明目的蛋白獲得了高效表達。在研究過程中通過自主構(gòu)建和修飾的pSUMO Vector原核表達載體與SUMO蛋白酶，解決了融合蛋白表達的兩大關(guān)鍵性技術(shù)問題:一是表達外源蛋白的溶解性問題。通過在表達載體中引入SUMO融合標簽顯著提高了外源蛋白的可溶性表達水平，促進其正確折疊，保證其生物學活性。二是融合標簽的去除問題。本研究通過SUMO蛋白酶-Ⅰ對目標蛋白和融合標簽進行分離，并且由于融合標簽和蛋白酶［10］都具有組氨酸標記，在通過層析柱時兩者均可被吸附，達到一次洗脫目的蛋白的效果，不僅得到的蛋白純度較高，而且大大節(jié)約了研究的時間和成本。

在研究中對純化的rhIL-15生物活性進行研究。純化后的rhIL-15可以誘導CTLL2細胞的增殖，大大增強rhIL-15誘生的LAK細胞對B16-F10和HepG2 細胞的殺傷活性，與文獻報道一致［11，12］。LAK細胞被認為是非特異性細胞免疫治療的主要功能細胞，動物體內(nèi)實驗和人體試用均顯示出抗感染、抗腫瘤的療效［13，14］。本實驗發(fā)現(xiàn) rhIL-15 能上調(diào)LAK殺傷活性，對H22荷瘤鼠模型腫瘤具有明顯的治療效果，這不僅在開發(fā)LAK細胞用于過繼免疫治療上有實際應用價值，而且為rhIL-15的臨床應用奠定基礎。

綜上，在外源蛋白的表達水平、產(chǎn)物的可溶性和生物學活性方面pSUMO Vector表達系統(tǒng)優(yōu)于其他的原核表達系統(tǒng)，是表達目的蛋白的理想工具。本實驗利用SUMO表達系統(tǒng)高效可溶性表達人白細胞介素15，并且獲得了高純度高活性的rhIL-15，動物實驗結(jié)果也表明獲得的rhIL-15具有抗腫瘤效果，為今后本實驗室進一步研究rhIL-15的功能奠定了基礎。

1 Grabstein K H，Eisenman J，Shanebeck K et al．Cloning of a T-cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor．［J］．Science，1994;264(5161):965-968．

2 Shanmugham L N，Petrarca C，F(xiàn)rydas S et al．IL-15 an immunoregulatory and anti-cancer cytokine．Recent advances［J］．J Exp Clin Cancer Res，2006;25(4):529-536．

3 Vadim B，Elena B，Ralf P et al．IL-15/IL-15 receptor biology:A guided tour through an expanding universe［J］．Cytokine Growth Factor Reviews，2006;17(4):259-280．

4 Jason G，Chiu W K，Weng N．Gene expression and generation of CD28-CD8 T cells mediated by interleukin-15［J］．Experimental Gerontology，2007;42(5):412-415．

5 Hiroki K，Hitoshi O，Takamistu S et al．Production of interleukin 15 by human colon cancer cells is associated with induction of mucosal hyperplasia，angiogenesis，and metastasis ［J］．Clin Cancer Res，2003;9(4802):4802-4810．

6 Elizabeth D，Sarah R，Maria F M et al．IL-15 has innate antitumor activity independent of NK and CD8 T cell［J］．J Leukocyte Biology，2010;88(3):529-536．

7 Gregg A D，Anne B，Alora L V．Cloning and expression of feline interleukin 15．［J］．Cytokine，2005;29(2):77-83．

8 Su Z，Huang Y，Zhou Q et al．High-level expression and purification of human epidermal growth factor with SUMO fusion in Escherichia coli［J］．Protein Peptide Letters，2006;13(8):785-792．

9 Michael P M，Michael R M，Oxana A M et al．SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins［J］．Struct Funct Gen，2004;5(1-2):75-86．

10 傅俊華，王 琪，尹杰超 et al．融合蛋白GST-Ulp1p在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒［J］．生物工程學報，2010;26(6):837-842．

11 Chaudhry U I，Plitas G，Burt B M et al．NK dendritic cells expanded in IL-15 exhibit antitumor responses in vivo［J］．J Immunol，2007;179(7):4654-4660．

12 Evans R，F(xiàn)uller J A，Christianson G et al．IL-15 mediates antitumor effects after cyclophosphamide injection of tumor-bearing mice and enhances adoptive immunotherapy:the potential role of NK cell subpopulations［J］．Cellular Immunology，1997;179(1):66-73．

13 Klebanoff C A，F(xiàn)inkelstein S E，Surman D R et al．IL-15 enhances the in vivo antitumor activity of tumor-reactive CD8+T cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(7):1969-1974．

14 Takeuchi E，Yanagawa H，Suzuki Y et al．Comparative analysis of interleukin 15 and interleukin 2 for induction of killer activity and of type 2 cytokine production by mononuclear cells from lung cancer patients［J］．Br J Cancer，1998;78(5):616-620．