袁 鯤，鄔靖敏,，豆清婭，李 軍，鄒明祥

（1.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410008；）

金黃色葡萄球菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌）是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,其耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)由于對(duì)幾乎所有β 內(nèi)酰胺類(lèi)藥物（包括頭孢菌素、含酶抑制劑復(fù)合抗生素以及碳青霉烯類(lèi)藥物）耐藥，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。然而，關(guān)于金葡菌的現(xiàn)有研究主要集中于開(kāi)放性部位來(lái)源標(biāo)本，如痰液、分泌物等，而探討無(wú)菌部位來(lái)源菌株研究較少。本研究對(duì)分離自無(wú)菌部位的金葡菌采用瓊脂稀釋法定量檢測(cè)其敏感性，PCR 技術(shù)對(duì)耐甲氧西林金葡菌進(jìn)行SCCmec 基因同源性分析及殺白細(xì)胞毒素（PVL）基因的檢測(cè)，以了解無(wú)菌部位分離金葡菌的耐藥性和分子流行病學(xué)特征，為臨床預(yù)防和控制其感染以及合理應(yīng)用抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

臨床菌株來(lái)源于2011年8月至2012年6月本院無(wú)菌部位（血液、骨髓、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液、穿刺液、腦脊液）分離的50 株非重復(fù)金黃色葡萄球菌。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923 購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，ATCC43300（MRSA）由法國(guó)梅里埃公司惠贈(zèng)。

1.1.2 儀器與試劑

VITEK-2 微生物分析系統(tǒng)及配套的鑒定卡和藥敏卡(法國(guó)梅里埃生物公司)；BACTEC-9240 血培養(yǎng)儀（美國(guó)BD 公司）；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；頭孢西丁（30 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）藥敏紙片為英國(guó)OXOID 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離培養(yǎng)及鑒定

按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3 版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。將培養(yǎng)于血瓊脂培養(yǎng)基上18～24h的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色、觸酶試驗(yàn)、試管法血漿凝固酶試驗(yàn)等初步鑒定，以Vitek-2 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

1.2.2 耐甲氧西林金葡菌（MRSA）鑒定

將新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌用無(wú)菌生理鹽水配制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊膽乙?無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于厚度為4mm的M-H 瓊脂平皿上，待水份被吸收后，分別將苯唑西林和頭孢西丁紙片貼于瓊脂表面。頭孢西丁含量為30μg/片,置35 ℃孵育18h。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：頭孢西丁抑菌圈直徑≤21 mm為耐藥,≥22 mm 為敏感。苯唑西林含量為1μg/片,在35 ℃孵育24h。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：苯唑西林抑菌圈直徑≤10mm 為耐藥,≥13 mm 為敏感。2 種藥物中有任一結(jié)果為耐藥，則菌株對(duì)苯挫西林耐藥，即為MRSA，同 時(shí) 以 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 ATCC25923和ATCC43300 分別作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法檢測(cè)檢測(cè)金葡菌對(duì)抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果以2010年CLSI 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[1]。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA 提取

從35℃過(guò)夜培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑取3～5個(gè)金葡菌菌落于0.5ml的無(wú)菌生理鹽水中，配制成約2 麥?zhǔn)蠞岫鹊木海?0000g 離心3min，盡量吸盡上清。向沉淀中加入180μL 溶菌酶（終濃度為20mg/mL）充分混勻，37℃水浴50min 后加入20μL蛋白酶K 溶液，混勻。其余步驟按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取的基因組DNA 置-80℃保存。

1.2.5 SCCmec 分型及PVL 基因檢測(cè)PCR 檢測(cè)PVL 基因及多重PCR 檢測(cè)SCCmec 相關(guān)基因。此部分試驗(yàn)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，所用試驗(yàn)方法將另文發(fā)表。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

將病人資料及MIC 值輸入Whonet 5.6 進(jìn)行處理，結(jié)果按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)2010 版文件有關(guān)金黃色葡萄球菌的折點(diǎn)判定為敏感、中介或耐藥。計(jì)數(shù)資料采用χ2 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 13.0。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌的標(biāo)本分布

50 株金黃色葡萄球菌均來(lái)自于無(wú)菌部位。其中，血液標(biāo)本27 株（54.0%），其次是穿刺液12 株（24.0%），腹水4 株（8.0%），腦脊液3 株(6.0%)，骨髓2 株(4.0%)，胸水和關(guān)節(jié)液各1 株(2.0%)；住院患者43人（86.0%），門(mén)診患者7人（14.0%）。

2.2 金葡菌對(duì)抗菌藥物的敏感性檢測(cè)結(jié)果

金葡菌對(duì)青霉素、紅霉素的耐藥率最高，分別達(dá)90.0%和62.0%，對(duì)氯霉素、利福平、左氧氟沙星的耐藥率相對(duì)較低，分別為2.0%、16.0%、16.0%；對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率在18.0%-30.0%之間（見(jiàn)表1）。50 株金葡菌中，甲氧西林敏感菌株（MSSA）為35 株（70.0%），MRSA 為15 株（30.0%），二者對(duì)青霉素的耐藥率均很高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除對(duì)萬(wàn)古霉素，替加環(huán)素，替考拉寧，利奈唑胺，達(dá)托霉素的敏感率均為100%外，對(duì)其余12 種藥物的耐藥率，MRSA 明顯高于MSSA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

2.3 SCCmec 分型及PVL 基因檢測(cè)結(jié)果

15 株 MRSA中，11 株 為 SCCmec Ⅲ型（73.3%），4 株為SCCmecⅣ型占26.7%，PVL 基因擴(kuò)增均為陰性。

表1 50 株金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的藥敏性

表2 MRSA 與MSSA 對(duì)常用抗菌藥的耐藥率比較

3 討論

本研究中無(wú)菌部位標(biāo)本共檢出50 株金黃色葡萄球菌。其中，MRSA 為15 株，檢出率為30.0%，明顯低于衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的50.5%[2]和本課題組前期研究的54.5%[3]。同時(shí)，50 株金葡菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率低于全國(guó)水平[2]，推測(cè)可能與本研究標(biāo)本僅來(lái)源于無(wú)菌部位有關(guān)。說(shuō)明在細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中，應(yīng)該重視感染部位的區(qū)分，以便臨床掌握相關(guān)流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)經(jīng)驗(yàn)選用抗菌藥物。在被檢測(cè)的18 種藥物中，金葡菌對(duì)青霉素耐率最高，達(dá)90.0%，說(shuō)明青霉素已不能用于金葡菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療。與MSSA 相比，MRSA 對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率均高于MSSA，說(shuō)明臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常規(guī)開(kāi)展MRSA 監(jiān)測(cè)。萬(wàn)古霉素是治療MRSA 感染的首選藥物，但在臨床應(yīng)用中應(yīng)注意異質(zhì)性萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（hVISA）的出現(xiàn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥性。

MRSA 多重耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)生低親和力青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a) 所致，其由位于葡萄球菌盒式染色體SCCmec 上的mecA 基因編碼。采用SCCmec 分型方法對(duì)MRSA 進(jìn)行分子生物學(xué)分型，是判斷菌株親緣關(guān)系和傳播范圍的重要手段。迄今為止，在全世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)11 種不同的SCCmec型別，其中又以Ⅰ～Ⅴ為主[4]。Ⅱ和Ⅲ型常見(jiàn)于醫(yī)院獲得性MRSA，常整合一些其他類(lèi)抗菌藥物的耐藥基因,表現(xiàn)為對(duì)多種抗菌藥物耐藥，對(duì)非β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥率相對(duì)較高。Ⅳ、Ⅴ型多見(jiàn)于社區(qū)獲得性MRSA，很少攜帶其他耐藥基因,僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)和紅霉素等少數(shù)抗菌藥物耐藥，對(duì)非β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥率相對(duì)較低[5-6]。本研究中，MRSA分為SCCmecⅢ和Ⅳ2 種型別，分別占73.3%和26.7%，表明本院MRSA 以SCCmecⅢ型為主，與西安[7]和寧夏[8]地區(qū)報(bào)道的研究結(jié)果相近,而與大連[9]主要以SCCmecⅡ?yàn)橹鞑煌Ｕf(shuō)明MRSA的流行可能存在地域和時(shí)間特征。值得注意的是本研究從門(mén)診患者中分離出2 株SCCmecⅢ型MRSA,提示多重耐藥MRSA 可能向社區(qū)傳播。

PVL 是一種能破壞白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞導(dǎo)致中毒性炎癥反應(yīng)的膜鉆孔毒素，能引起淺表皮膚軟組織感染和深部組織及臟器感染。由于攜帶PVL基因的金葡菌毒力強(qiáng)，感染后與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。因此，檢測(cè)菌株是否產(chǎn)PVL 毒素對(duì)臨床評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有十分重要的價(jià)值。本研究中所有MRSA 均未檢測(cè)到PVL 基因，與文獻(xiàn)報(bào)道的PVL 主要存在于社區(qū)獲得性MRSA的結(jié)論一致[10]。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [S].M100-S20,2010.

[2]肖永紅，沈萍，魏澤慶，等.Mohnarin 2011年度全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22 (22)：4946-4952.

[3]鄒明祥，武文君，鄔靖敏等.長(zhǎng)沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌的耐藥監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24（5）：415-418

[4]Shore AC,Deasy EC,Slickers P,et al.Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA,mecI,mecR1,blaZ,and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin -resistant Staphylococcus aureus.Antimicrob Agents Chemother.2011.55(8)：3765-3773.

[5]Song J H,Hsueh P R,Chung D R,et al.Spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus between the community and the hospitals in Asian countries：an ANSORP study [J].J Antimicrob Chemother,2011,66(5)：1061-1069.

[6]馬笑雪，孫丹丹，王斯，等.醫(yī)院內(nèi)流行社區(qū)型MRSA的分子生物學(xué)特點(diǎn)分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2010,5(10)：725-728.

[7]王蕾，李武平，劉冰，等.西安地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的SCCmec 基因分析 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22(3)：504-508.

[8]崔學(xué)光，魏軍，賈偉，等.燒傷科耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素基因檢測(cè)及SCCmec 分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(13)：2721-2723.

[9]陳潔，李巖，王晶，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec 基因分型及耐藥譜分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(5)：894-897.

[10]Nichol K A,Adam H J,Hussain Z,et al.Comparison of community -associated and health care -associated methicillin -resistant Staphylococcus aureus in Canada：results of the CANWARD 2007-2009 study [J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,69(3)：320-325.