張秀琴，謝朝暉

(1.邵陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南 邵陽(yáng)422000,2.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的疾病。由于一線化療后順鉑耐藥的存在造成卵巢癌患者五年生存率僅為20%～ 30%，因此克服卵巢癌的化療耐受性對(duì)提高卵巢癌臨床治療效果具有重要意義。最近有研究報(bào)道Akt 是卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的重要決定因素。Akt 能促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡并且調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[1-3]。Akt在多種人類惡性腫瘤中存在高表達(dá)，這將直接導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性降低[4-5]。

8-溴-7-甲氧基白楊素(8-bromo-7-methoxychrysin,BrMC)是白楊素的一種衍生物。已有研究表明BrMC 對(duì)結(jié)腸癌、胃癌以及肝癌細(xì)胞等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有較白楊素更強(qiáng)的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[6-8]。本文研究BrMC 對(duì)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP 細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討在此細(xì)胞凋亡過(guò)程中Akt 蛋白磷酸化水平的變化，以期為探索臨床順鉑耐藥卵巢癌患者的新輔助治療方案提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

BrMC 按照文獻(xiàn)[8]所述方法在湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備(分子量：347，性狀：黃色晶體，純度：99.0%)，碘化丙啶與白楊素購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞死亡ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司；小鼠抗人p-Akt、total Akt和β-actin 一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；ECL Western blot 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自NENTM Life Science。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)武漢市），用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，加100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 PI 染色FCM 分析

按照文獻(xiàn)[9]方法，A2780/DDP 細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 小時(shí)，分別加入含不同濃度的BrMC(2.5、5.0和10.0 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 小時(shí)；50.0 μmol/L 白楊素作為凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照；0.1%DMSO 作為溶媒對(duì)照。收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液制備單細(xì)胞懸浮液，再用冷的磷酸鹽緩沖液洗兩次，700mL/ L的酒精溶液固定，4℃放置過(guò)夜，碘化丙啶（PI）染色，用EPICS XL 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULTER 公司) 測(cè)定10000 個(gè)細(xì)胞的DNA 含量，SYSTEM II 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.4 組蛋白/DNA 碎片的ELISA 檢測(cè)

根據(jù)廠商提供的說(shuō)明書(shū)描述的實(shí)驗(yàn)步驟操作，用細(xì)胞凋亡ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)經(jīng)BrMC 處理后的細(xì)胞凋亡程度。用EXL-800 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以405 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。

1.5 Western Blot 分析

收集受試物處理細(xì)胞，用PBS 洗滌3 次，加入含有0.1 mol/L的NaCl，0.01 mol/ L的Tris-Cl（pH值7.6），0.001 mol/ L的乙二胺四乙酸（pH 8.0），1μg/mL 抑肽酶，100 μg/mL 苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞，然后，在4℃下13 000 r/min 離心10 分鐘。取上清液并加入等容積的SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水中孵育10 分鐘，然后，進(jìn)行10%的SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜在含50 g/ L的脫脂牛奶的TBST 緩沖液中常溫下處理2 小時(shí)，然后，分別與p-Akt、total Akt和β-actin 一抗(1：2000 稀釋) 4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)過(guò)TBST 洗膜30分鐘，加入相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 小時(shí)，接著用TBST 緩沖液洗膜三次，每次15 分鐘。結(jié)果用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL detection kit)顯示，β-actin作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0 for windows evaluation 軟件，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用One Way ANOVA 行方差分析。P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 BrMC 對(duì)A2780/DDP 細(xì)胞凋亡率的影響

PI 染 色FCM 分 析 結(jié)果 顯 示，BrMC(2.5、5.0、10.0 μmol/L) 作用48h，A2780/DDP 細(xì)胞凋亡率增加，呈劑量依賴性。50 μmol/L 白楊素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)度與5.0 μmol/L BrMC 相當(dāng)，但明顯低于10 μmol/L BrMC。(圖1)。

圖1 BrMC 對(duì)人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 BrMC 對(duì)A2780/DDP 細(xì)胞組蛋白/DNA 碎片含量的影響

細(xì)胞凋亡ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定結(jié)果表明，BrMC (2.5、5.0、10.0 μmol/L) 處 理的人 卵 巢 癌A2780/DDP 細(xì)胞中組蛋白/DNA 碎片含量增加，呈濃度依賴性(圖2)。

圖2 BrMC 對(duì)人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞組蛋白/ DNA 碎片含量的影響

2.3 BrMC 對(duì)人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞Akt 蛋白磷酸化的影響

Western Blot 分 析 結(jié)果表 明，BrMC (5.0、10.0 μmol/L)處理的人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，且呈濃度依賴性下降，而總Akt 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(圖3)。

圖3 BrMC 對(duì)人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞p-Akt 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

白楊素是一種具有廣泛生物活性的天然黃酮類化合物，但因其在腸道內(nèi)吸收少，并且5,7 位羥基在體內(nèi)易迅速與葡萄糖醛酸結(jié)合代謝以致活性降低，使其臨床應(yīng)用受到限制[10]，而甲氧烷基的引入能提高其肝臟代謝穩(wěn)定性和腸道吸收率，從而提高其生物利用度和增強(qiáng)抗腫瘤活性[11]。另外，有研究已經(jīng)證實(shí)ChR 溴代衍生物比先導(dǎo)化合物具有更強(qiáng)的生物活性[12]。8-溴-7-甲氧基白楊素是一種新型白楊素衍生物，比其先導(dǎo)物白楊素有更強(qiáng)的抗實(shí)體瘤作用[6]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BrMC 比ChR 更能夠有效地誘導(dǎo)人卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/DDP 細(xì)胞凋亡，PI 染色FCM 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10.0 μmol/L BrMC 作用A2780/DDP 細(xì)胞48h 細(xì)胞凋亡率為34.8%，而50.0 μmol/L 白楊素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率僅為21.9%。

Akt 是一種受PIP3 調(diào)控的絲氨酸-蘇氨酸蛋白酶，與多種細(xì)胞的存活信號(hào)相關(guān)聯(lián)，一旦被激活，Akt 通過(guò)Bad[13]和caspase-9[14]等底物磷酸化行使抗凋亡效應(yīng)，直接調(diào)節(jié)凋亡機(jī)制，或通過(guò)人端粒酶催化蛋白亞單位、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄家族成員和IB 激酶等間接抑制凋亡[15-16]。為了進(jìn)一步探究BrMC 誘導(dǎo)A2780/DDP 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們采用Western blot 分別檢測(cè)A2780/DDP 細(xì)胞中p-Akt和Akt蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，BrMC (5.0、10.0μmol/L) 處理的人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞中p-Akt 蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，且呈濃度依賴性下降，而總Akt 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，從而提示BrMC 可能通過(guò)抑制Akt 活化誘導(dǎo)人卵巢癌耐藥A2780/DDP 細(xì)胞凋亡。

[1]Fraser M,Leung BM,Yan X,Dan HC,Cheng JQ,et al.p53 is a determinant of X-linked inhibitor of apoptosis protein/Akt-mediated chemoresistance in human ovarian cancer cells[J].Cancer Res,2003,63：7081-7088.

[2]Asselin E,Mills GB,Tsang BK.XIAP regulates Akt activity and caspase-3-dependent cleavage during cisplatin-induced apoptosis in human ovarian epithelial cancer cells[J].Cancer Res,2001,61：1862-1868.

[3]Yang X,Fraser M,Moll UM,Basak A,Tsang BK.Akt-mediated cisplatin resistance in ovarian cancer：modulation of p53 action on caspase -dependent mitochondrial death pathway[J].Cancer Res,2006;66：3126-3136.

[4]Cicenas J,Urban P,Vuaroqueaux V,Labuhn M,Kung W,Wight E,Mayhew M,Eppenberger U,Eppenberger-Castori S：Increased level of phosphorylated akt measured by chemiluminescence-linked immunosorbent assay is a predictor of poor prognosis in primary breast cancer overexpressing ErbB-2 [J].Breast Cancer Res,2005,7：R394-401.

[5]Semba S,Moriya T,Kimura W,Yamakawa M：Phosphorylated Akt/PKB controls cell growth and apoptosis in intraductal papillary-mucinous tumor and invasive ductal adenocarcinoma of the pancreas [J].Pancreas,2003,26：250-257.

[6]Zheng X,Meng WD,Xu YY,Cao JG,Qing FL.Synthesis and anticancer effect of chrysin derivatives [J].Bioorg Med Chem Lett,2003,13：881-884.

[7]Ai XH,Zheng X,Tang XQ,Sun L,Zhang YQ,Qin Y,Liu HQ,Xia H,Cao JG.Induction of apoptosis of human gastric carcinoma SGC-7901 cell line by 5,7-dihydroxy-8-nitrochrysin in vitro [J].World J Gastroenterol,2007,13：3824-3828.

[8]Yang XH,Zheng X,Cao JG,Xiang HL,Liu F,Lv Y.8-Bromo-7-methoxychrysin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells involves ROS and JNK [J].World J Gastroenterol,2010,16(27)：3385-93.

[9]Xie ZH,Quan MF,Liu F,Cao JG,Zhang JS.5-allyl-7-gen -difluoromethoxy chrysin enhances TRAIL -induced apoptosis in human lung carcinoma A549 cells [J].BMC Cancer,2011,11：322.

[10]Hadjeri M，Barbier M，Ronot X，et a1.Modulation of Pglycopretein mediated multidrog resistance by flavonoid derivatives and analogues [J].Med Chem,2003,46(11)：2125-2131.

[11]Wen X,Walle T.Methylated flavonoids have greatly improved intestinal absorption and metabolic stability[J].Drug Metab Dispos,2006,34：1786-1792

[12]Park H,Dao TT,Kim HP.Synthesis and inhibition of PGE2 production of 6,8-disubstituted chrysin derivatives[J].Eur J Med Chem,2005,40：943-948.

[13]Datta SR,Dudek H,Tao X,Masters S,Fu H,Gotoh Y,Greenberg ME：Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery [J].Cell,1997,91：231-241.

[14]Cardone MH,Roy N,Stennicke HR,Salvesen GS,Franke TF,Stanbridge E,Frisch S,Reed JC：Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation [J].Science,1998,282：1318-1321.

[15]譚勤芳，向紅琳，張堅(jiān)松.5，7-二甲氧基黃酮誘導(dǎo)白細(xì)胞U937 細(xì)胞凋亡[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，7（2）：14-17.

[16]戴勇，周蓓，肖立紅.Bim 介導(dǎo)白楊素誘導(dǎo)肝癌Hep 3B 細(xì)胞凋亡[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，9（3）：14-16,20.