洪 嶺，張云香，陳信良

(1.同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200040;2.山東省濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261041;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院婦科，上海 200030)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以性腺軸失調(diào)為主的一個復(fù)雜的全身性神經(jīng)-內(nèi)分泌-代謝網(wǎng)絡(luò)失控的癥候群，其發(fā)病機制至今不是十分清楚。目前認為PCOS的發(fā)病機制與以下因素有關(guān):腎上腺功能初現(xiàn)亢進、下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常、胰島素樣生長因子異常、胰島素抵抗、遺傳因素等，但任何單一學(xué)說都難以全面解釋PCOS的所有臨床表現(xiàn)和生化、病理改變，PCOS已成為當今婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的一個研究熱點和最復(fù)雜難點。近幾年，國內(nèi)外許多文獻報道PCOS患者體內(nèi)的許多炎癥因子，如腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)、白細胞介素 6(IL-6)等水平高于正常人群，PCOS的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子具有密切關(guān)系[1-12]。PCOS類似糖尿病、動脈粥樣硬化等，可能也是一種炎癥性疾病。這里的炎癥不同于有紅、腫、熱、痛、發(fā)熱等表現(xiàn)的急性炎癥，而是由人體免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的一種慢性、低度的非特異性的亞臨床炎癥狀態(tài)或促炎癥狀態(tài)(proinflammatory state)，患者體內(nèi)的許多炎癥因子水平高于正常人群。有學(xué)者指出這種慢性，低度亞臨床炎癥(炎癥學(xué)說)可能也是PCOS的發(fā)病機制之一。那么炎癥因子引發(fā)PCOS的機制是什么?本研究將通過體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)膜細胞進一步探討TNF-α與PCOS發(fā)病機制的關(guān)系。

材料和方法

一、試劑與儀器

豬重組 TNF-α(prospec)，DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液(Hyclone)，膠原酶Ⅱ(TBD)，透明質(zhì)酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，胎牛血清 (FBS，杭州四季青)，CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，36%乙酸溶液(上海化學(xué)試劑公司)，睪酮放射免疫測定試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。CO2細胞培養(yǎng)箱(HEPA CLASS 100)，倒置熒光顯微鏡(TE2000-U，Nikon Eclipse)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)，γ放射免疫計數(shù)器(Gc-911，安徽合肥中國科大中佳公司)。

二、原代豬卵泡內(nèi)膜細胞的分離和培養(yǎng)

取新鮮的豬卵巢，置于放有雙抗的冰生理鹽水中(青霉素、鏈霉素各含80萬IU/500 mL生理鹽水)，冰盒內(nèi)保存，于2 h內(nèi)進行試驗。試驗時用生理鹽水反復(fù)沖洗，將卵巢放入平皿中，選取直徑約4～6 mm的健康卵泡，在解剖顯微鏡下用顯微解剖剪小心將卵泡對半剪開，使草黃色卵泡液流出，用自制刮匙仔細刮除附著在其表面的顆粒細胞，用顯微鑷剝離出卵泡內(nèi)膜(呈帽狀)，并用生理鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次。將卵泡內(nèi)膜剪碎，加入酶液[0.25% 膠原酶Ⅱ、0.05% 透明質(zhì)酸酶、0.05%胰蛋白酶]，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)消化20～50 min，期間每隔10 min用移液管反復(fù)吹打以利于卵泡內(nèi)膜的消化，以適量含血清的培養(yǎng)基終止消化后，以100目不銹鋼濾網(wǎng)濾過。以200×g離心5 min，除去酶，生理鹽水洗1次。將獲取的卵泡內(nèi)膜細胞懸浮于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)內(nèi)，0.04%臺盼蘭染色顯示活力(＞70%)，待用。

三、卵泡內(nèi)膜細胞上清液睪酮濃度的測定

采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測定24孔培養(yǎng)板中細胞上清液的睪酮濃度，按照試劑盒說明書，依次加入標準品和樣品50 μL、125I標記的睪酮100μL及睪酮抗體100 μL，充分混合;37℃孵育1 h;加入沉淀劑0.5 mL，室溫放置15 min，1200 ×g離心 15 min;棄去上清，瀝干試管，γ記數(shù)器檢測。

四、CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒的檢測原理

CFDA SE的全稱為Carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，分子式為 C29H19NO11，相對分子質(zhì)量為 557.47，CAS號碼為 150347-59-4。CFDA SE可以通透細胞膜，進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶(esterase)催化分解成羥基熒光素乙酰乙酸(CFSE)，CFSE可以偶發(fā)性地并不可逆地和細胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其他氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并標記這些蛋白。在加入熒光探針CFDA SE后大約24 h即可充分標記細胞。被CFDA SE標記的非分裂細胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標記的時間可達數(shù)月。CFDA SE標記細胞的熒光非常均一，比以前使用的其他細胞示蹤熒光探針如PKH26的熒光更加均一，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也更均勻。由于CFDA SE標記細胞的熒光非常均勻和穩(wěn)定，每分裂1次，子代細胞的熒光會減弱一半，這樣通過流式細胞儀檢測就可以檢測出沒有分裂的細胞、分裂1次的細胞(1/2的熒光強度)、分裂2次的細胞(1/4的熒光強度)、分裂3次的細胞(1/8的熒光強度)以及類似的其他分裂次數(shù)的細胞。使用CFDA SE可以檢測分裂多達8次或更多次數(shù)的細胞增殖。

CFDA SE標記細胞后通常用流式細胞儀進行細胞增殖檢測，CFDA SE標記細胞呈綠色熒光，檢測時的激發(fā)波長可以選擇488 nm，此時的發(fā)射波長為518 nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。CFDA SE標記的細胞也可以用熒光顯微鏡進行觀察。CFDA SE標記的細胞無論在體外還是體內(nèi)都不會使鄰近細胞染色。即CFDA SE熒光探針完成標記后不會從一個細胞轉(zhuǎn)移到鄰近細胞。

五、豬原代卵泡內(nèi)膜細胞CFDA SE的標記及培養(yǎng)

將豬卵泡內(nèi)膜細胞按照CFDA檢測試劑盒的說明書完成CFDA標記，用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成1×105/mL細胞懸液，按每孔1 mL加入到24孔培養(yǎng)板中，加入TNF-α，使其終濃度分別為0、10、100 和 1000 pg/mL，0 pg/mL 為對照組，每種濃度梯度均做3復(fù)孔。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后換液，換液72 h后用流式細胞儀檢測細胞增殖情況。

六、流式細胞儀檢測卵泡內(nèi)膜細胞增殖情況

常規(guī)胰酶消化、DMEM/F12培養(yǎng)液中和胰酶后，從24孔培養(yǎng)板中將每組細胞轉(zhuǎn)移到流式管中，200×g離心5 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)再洗滌1次，用PBS稀釋到適宜濃度后上機檢測。

流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測:光源488 nm的氫離子激光，上機前先用標準微球調(diào)整儀器，使變異系數(shù)在2%以內(nèi)，上機后收集10000個細胞，熒光強度以對數(shù)放大，光散射數(shù)據(jù)存硬盤，用 FlowJo軟件分析每組細胞的平均熒光強度。

七、統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TNF-α對豬卵泡內(nèi)膜細胞睪酮分泌的影響

TNF-α濃度為 10、100和 1000 pg/mL 3個試驗組，在24、48和72 h 3個時間點分別與空白對照組(不加藥組，TNF-α濃度0 pg/mL)相比，每個濃度做3復(fù)孔，重復(fù)3次。結(jié)果顯示，在加入 TNF-α 后，24、48和 72 h 3個時間點分別與空白對照組比較，睪酮水平未見明顯變化，見表1。

表1 TNF-α刺激下卵泡內(nèi)膜細胞所分泌的睪酮與對照組的比較 (ng/mL)

二、TNF-α對豬卵泡內(nèi)膜細胞增殖情況的影響

在TNF-α (100和1000 pg/mL)刺激72 h后，卵泡內(nèi)膜細胞的平均熒光強度(MFI)與空白對照組(TNF-α 0 pg/mL)相比明顯降低(分別為53.2 ±11.59和66.87 ±14.8，P=0.013;47.55 ±7.31 和 66.87 ± 14.8，P=0.001);而 TNF-α(10 pg/mL)與空白對照組(TNF-α 0 pg/mL)相比，沒有出現(xiàn)明顯變化(60.2 ±9.20和 66.87 ±14.8，P=0.211)。

討 論

1985年Shalaby把巨噬細胞產(chǎn)生的TNF命名為TNF-α，把 T淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)命名為 TNF-β，兩者生物學(xué)作用極為相似。人的TNF-α基因長約2.76 kb，相對分子質(zhì)量為17000。TNF-α來源包括各種免疫細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞和平滑肌細胞等，其中活化的單核巨噬細胞是其主要來源。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如殺傷或抑制腫瘤細胞;提高中性粒細胞的吞噬能力，增強抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒反應(yīng)(ADCC)功能;抗感染;引起發(fā)熱，并誘導(dǎo)肝細胞急性期蛋白的合成;抑制病毒的復(fù)制;在調(diào)節(jié)機體組織糖、脂肪代謝中也起重要作用。

楊雪峰等[13]報道無論是PCOS伴肥胖組，還是體重正常PCOS組血漿TNF-α水平均高于正常對照人群。Peral等[14]報道，腫瘤壞死因子受體Ⅱ基因(the tumour necrosis factor receptor superfamily 1B gene，TNFRSF1B)與 PCOS 發(fā)病有關(guān)。第6外顯子部位的M196R(676T→G)變異與其第4內(nèi)含子CA微衛(wèi)星重復(fù)多態(tài)性呈連鎖不平衡，M196R出現(xiàn)頻率在PCOS組(30.3%)和對照組(15.3%)婦女中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);該結(jié)果顯示，TNFRSF1B第 6外顯子M196R多態(tài)性與PCOS和高雄激素血癥密切相關(guān)。

典型的PCOS卵巢組織形態(tài)學(xué)上會發(fā)生如下變化:卵巢雙側(cè)硬化性多囊改變，卵巢被膜呈纖維化或膠原化增厚，表面飽滿、光滑，呈珍珠白色，體積較正常卵巢增大2～3倍，切面可見卵巢的白膜均勻增厚，皮質(zhì)區(qū)增寬，被膜下有多個直徑2～9 mm囊狀卵泡或較大儲留卵泡囊腫，罕見黃體或白體，卵巢的髓質(zhì)區(qū)增厚，伴有水腫。鏡下顯示，卵巢的白膜組織呈彌漫性增厚，較正常厚3～4倍，均由膠原化的纖維組織所組成。白膜下有許多不同成熟階段的卵泡及閉鎖的卵泡存在，卵泡內(nèi)顆粒細胞少而稀疏，卵泡膜細胞增生，卵巢間質(zhì)有時黃素化，但卵泡無排卵跡象。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)膜細胞中加入炎癥因子TNF-α后，睪酮分泌沒有明顯變化，但卵泡內(nèi)膜細胞的增殖能力卻加強，說明TNF-α具有促進卵泡內(nèi)膜細胞增殖的作用，這個功能可能與PCOS患者發(fā)生卵巢白膜增厚、卵泡內(nèi)膜細胞增生病變有關(guān)。TNF-α引起細胞增殖的機制與激活如Jun氨基末端激酶(JNK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[15];TNF-α 還可引起胰島素抵抗(IR)[2]，繼而由 IR 參與 PCOS的發(fā)生。

[1]曾玖芝，周豐寧，沈宗姬，等.白細胞介素18與多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗關(guān)系探討[J].中國婦幼保健，2008，23(9):1193-1195.

[2]Tarkun I，Cetinarslan B，Türemen E，et al.Association between circulating tumor necrosis factor-alpha，interleukin-6，and insulin resistance in normal-weight women with polycystic ovary syndrome[J].Metab Syndr Relat Disord，2006，4(2):122-128.

[3]Dumesic DA，Abbott DH，Padmanabhan V.Polycystic ovary syndrome and its developmental origins[J].Rev Endocr Metab Disord，2007，8(2):127-141.

[4]Radomski D，Orzechowska A，Barcz E.Present conceptions of etiopathogenesis of polycystic ovary syndrome[J].Ginekol Pol，2007，78(5):393-399.

[5]Escobar-Morreale HF，Calvo RM，Sancho J，et al.TNF-alpha and hyperandrogenism:a clinical，biochemical，and molecular genetic study[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86(8):3761-3767.

[6]Orio F，Vuolo L，Palomba S，et al.Metabolic and cardiovascular consequences of polycystic ovary syndrome[J].Minerva Ginecol，2008，60(1):39-51.

[7]Guzelmeric K，Alkan N，Pirimoglu M，et al.Chronic inflammation and elevated homocysteine levels are associated with increased body mass index in women with polycystic ovary syndrome[J]. Gynecol Endocrinol，2007，23(9):505-510.

[8]Benson S，Janssen OE，Hahn S，et al.Obesity，depression，and chronic low-grade inflammation in women with polycystic ovary syndrome[J].Brain Behav Immun，2008，22(2):177-184.

[9]Shroff R，Kerchner A，Maifeld M，et al.Young obese women with polycystic ovary syndrome have evidence of early coronary atherosclerosis[J]. J Clin Endocrinol Metab，2007，92(12):4609-4614.

[10]Moran LJ，Noakes M，Clifton PM，et al.C-reactive protein before and after weight loss in overweight women with and without polycystic ovary syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab，2007，92(8):2944-2951.

[11]Elks CM，F(xiàn)rancis J.Central adiposity，systemic inflammation，and the metabolic syndrome[J].Curr Hypertens Rep，2010，12(2):99-104.

[12]余 帆.肥胖型多囊卵巢綜合征患者血清炎癥因子的變化及二甲雙胍干預(yù)效果的臨床研究[J].中國婦幼保健，2011，26(25):3878-3881.

[13]楊雪峰，任芬若，郭淑萍.多囊卵巢綜合征患者血清脂聯(lián)素水平與胰島素抵抗關(guān)系的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2006，41(4):261-263.

[14]Peral B，San Millán JL，Castello R，et al.Comment:the methionine 196 arginine polymorphism in exon 6 of the TNF receptor 2 gene(TNFRSF1B)is associated with the polycystic ovary syndrome and hyperandrogenism[J].J Clin Endocrinol Metab，2002，87(8):3977-3983.

[15]Korobowicz A.Biology of tumor necrosis factor type alpha(TNF-alpha)[J].Pol Merkur Lekarski，2006，21(124):358-361.