王玉萍，浦 春，武其文

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院檢驗科，安徽 蕪湖 241001)

染色體病是由于先天性的染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常引起的疾病，新生活嬰染色體異常發(fā)生率約為0.73%，有效預(yù)防方法是行產(chǎn)前診斷進行出生前干預(yù)。介入性產(chǎn)前診斷的方法主要有絨毛、羊水、臍血染色體檢查[1]。絨毛染色體檢查適用于孕8～11周左右，能早期發(fā)現(xiàn)染色體異常，主要運用于及早進行診斷的應(yīng)急病例和已停止發(fā)育的胎兒染色體分析。我們就絨毛染色體的培養(yǎng)、制作方法進行了探索，取得了滿意的結(jié)果。

一、材料和方法

1.病例來源 所有50例病例均來自于皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科門診自然流產(chǎn)孕婦，在行清宮術(shù)時留取標(biāo)本，其中第1次自然流產(chǎn)者31例，第2次自然流產(chǎn)者19例，年齡21～32歲之間，B超確認(rèn)孕周為8～11周之間。

2.試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液，GIBCO生產(chǎn)的AmnioMAXTM-Ⅱ;胰蛋白酶購自湖南湘雅生物技術(shù)有限公司;膠原酶Ⅱ購自BOMEI公司;秋水仙素購自廣州達(dá)暉公司;Giemsa染液購自湖南湘雅生物技術(shù)有限公司。

3.儀器 CO2培養(yǎng)箱由Thermo公司生產(chǎn);超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn);KX-21倒置顯微鏡、BX-51正置顯微鏡均為OLYMPUS公司生產(chǎn)。

4.方法 (1)標(biāo)本留取:在孕8～11周流產(chǎn)孕婦負(fù)壓吸宮時，無菌操作吸取絨毛組織放入無菌培養(yǎng)皿，加入無菌生理鹽水約5 mL，清洗數(shù)遍即可。挑取絨毛約10 g放入另一培養(yǎng)皿，加入0.25%胰酶3 mL，再加入1%膠原酶Ⅱ6 mL，輕輕混勻，剪碎絨毛組織，放入37℃培養(yǎng)40 min;(2)標(biāo)本培養(yǎng):將上述懸液離心，棄去上清液，剩余約0.5 mL，加入細(xì)胞培養(yǎng)液5 mL，混勻，將混懸液吸入培養(yǎng)瓶中，置37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);(3)細(xì)胞觀察:當(dāng)培養(yǎng)至4～7 d，將培養(yǎng)瓶取出，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，若細(xì)胞生長良好，細(xì)胞克隆較多，即可進行換液;(4)收獲:當(dāng)有較多圓形發(fā)亮的細(xì)胞出現(xiàn)時，即可收獲。加入秋水仙素1 h，將液體析出，加入預(yù)溫至37℃枸鹽酸鈉與胰酶9∶1配成的液體1 mL，反應(yīng)3 min，再將之前的液體倒回，用細(xì)胞刮刀刮下瓶壁上的細(xì)胞，倒入刻度離心管離心，棄去上清液，低滲20 min，再經(jīng)預(yù)固定、固定后滴片，75℃烘烤3 h，染色分析。

二、結(jié) 果

采用上述方法培養(yǎng)絨毛50例，檢出異常核型17例，異常核型檢出率34%，均為染色體數(shù)目異常。其中性染色體異常3例，常染色體異常14例，常染色體異常中多倍體2例，21-三體2例，非整倍體三體及單體10例。異常核型檢出情況見表1。

表1 50例絨毛異常核型檢出情況

三、討論

作為產(chǎn)前診斷的一部分，絨毛細(xì)胞培養(yǎng)染色體分析因牽涉到的環(huán)節(jié)多，胎兒流產(chǎn)后沒有再次復(fù)查的可能，使得其成為一項綜合性非常強的實驗技術(shù)。絨毛染色體技術(shù)包括直接制備和培養(yǎng)制備2種方法，直接制備由Simoni等[2]首次提出，但染色體分裂相對較少，易受母體污染，成功率較低;培養(yǎng)法獲得的染色體質(zhì)量好，核型多，母體污染少，嵌合體少，成功率較高。其中最主要是掌握好胰酶消化絨毛的時間、細(xì)胞培養(yǎng)和收獲時間。以下幾點值得注意。

首先胰酶消化的時間要掌握好，時間過短細(xì)胞少，核型少不夠分析，時間過長細(xì)胞受到破壞，也會導(dǎo)致核型減少。本室消化40 min，效果滿意。

細(xì)胞長到4 d后，每天要進行觀察，如果細(xì)胞克隆多，可換液;如果細(xì)胞克隆少，可吹吸細(xì)胞克隆，使細(xì)胞脫落下來，再移入另一培養(yǎng)瓶內(nèi)，繼續(xù)生長2～3 d，細(xì)胞克隆明顯增多。

收獲時時間要掌握好，當(dāng)大多數(shù)克隆細(xì)胞密度較高、細(xì)胞形態(tài)好、折光度較好、其中有較多圓形發(fā)亮的細(xì)胞出現(xiàn)時，即可收獲，此時細(xì)胞已進入分裂中期，分裂相多。

絨毛細(xì)胞是胚胎外胚層細(xì)胞，具有與胚胎組織相同的遺傳性狀，利用絨毛染色體檢查技術(shù)可以了解胚胎細(xì)胞的遺傳學(xué)特點，為探討流產(chǎn)的原因提供依據(jù)。據(jù)報道，在早期胎兒自然流產(chǎn)病例中，染色體異常占50%以上[3]，本研究中50例核型中，發(fā)現(xiàn)異常核型17例，異常核型檢出率34%，均為染色體數(shù)目異常。其中性染色體異常3例，常染色體異常14例，常染色體異常中多倍體2例，21-三體2例，非整倍體三體及單體10例。染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的主要原因，因為染色體數(shù)目異常的胚胎，遺傳缺陷大，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不平衡，致死性高[4]。本研究中異常核型檢出率低于報道，可能與標(biāo)本例數(shù)較少有關(guān)，但也充分說明了染色體異常是導(dǎo)致孕早期自然流產(chǎn)的主要因素，因此臨床遇有孕早期出血孕婦，不宜盲目保胎。本研究未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，有待于在今后的工作中繼續(xù)積累病例數(shù)進行統(tǒng)計。

絨毛染色體培養(yǎng)成功與否與檢測方法、標(biāo)本采集、稽留時間均有關(guān)[5]，本室50例標(biāo)本全部培養(yǎng)成功，這與嚴(yán)格掌握無菌操作、胚胎停止發(fā)育時間至吸宮時間短，流產(chǎn)絨毛標(biāo)本新鮮有關(guān)。

綜上所述，嚴(yán)格控制操作條件，用上述方法培養(yǎng)絨毛細(xì)胞成功率高，獲得的分裂相多，該法可用于孕早期流產(chǎn)胎兒原因分析。

[1]王 昕，王樹玉.產(chǎn)前診斷方法及其進展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，16(3):128-129.

[2]Simoni G，Brambati B，Danesino C，et al.Efficient direct chromosome analyses and enzyme determinations from chorionic villi samples in the first trimester of pregnancy[J].Hum Genet，1983，63(4):349-357.

[3]李 璞.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1989:96.

[4]孟 茜，王緒云.47例自然流產(chǎn)絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18(10):33.

[5]程麗村，趙欣榮，俞 青，等.絨毛染色體檢測在分析稽留流產(chǎn)原因中的運用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14(2):27.