宋云霄， 歐美賢，李水軍，張海晨，余 琛

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200031;2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200031)

血清肌酐是評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)。目前臨床常用的檢測(cè)方法有化學(xué)法和酶法，堿性苦味酸法(簡(jiǎn)稱Jaffe法)和肌氨酸氧化酶法(簡(jiǎn)稱酶法)是其代表方法，但均存在不同程度的特異性和可比性等問題[1-4]，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室肌酐的檢測(cè)性能還有待進(jìn)一步提高[5]。建立參考方法是解決Jaffe法和酶法肌酐檢測(cè)問題的有效途徑。國際上肌酐檢測(cè)的參考方法采用同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜法或者同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC-MS/MS)[6-9]。我們采用自建的 ID-LC-MS/MS，在方法學(xué)全面驗(yàn)證之后，與酶法和Jaffe法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)現(xiàn)有肌酐檢測(cè)方法與ID-LC-MS/MS的可比性。

材料和方法

一、試劑和儀器

1.試劑 肌酐標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)購自美國Sigma公司;肌酐-d3(同位素豐度98%)購自加拿大TRC公司;改良Jaffe法肌酐測(cè)定試劑盒(批號(hào):141012017)、Jaffe法肌酐測(cè)定試劑盒(批號(hào):141112011)、邁瑞常規(guī)生化復(fù)合校準(zhǔn)品(批號(hào):SM312)、邁瑞常規(guī)生化復(fù)合定值質(zhì)控品(正常水平批號(hào):050212003;病理水平批號(hào):QMP313)均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

2.儀器 ID-LC-MS/MS采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，由 Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司)和API 4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司)組成。酶法和Jaffe法采用邁瑞B(yǎng)S-800M全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

二、肌酐檢測(cè)方法

1.ID-LC-MS/MS 在50 μL血清中添加同位素肌酐-d3為內(nèi)標(biāo)，用甲醇沉淀蛋白，離心取上清液，經(jīng)高效液相色譜分離，以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描分析，檢測(cè)離子通道為114/86 amu(肌酐)和117/89 amu(內(nèi)標(biāo))。方法的線性范圍為4.4～885 μmol/L(0.5 ～ 100 μg/mL)，最低定量限為4.4 μmol/L。尿毒癥標(biāo)本及脂血、溶血、黃疸對(duì)肌酐分析無干擾。

2.酶法 采用邁瑞B(yǎng)S-800M全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，波長(zhǎng)為546 nm，溫度37℃，采用終點(diǎn)法分析類型，反應(yīng)方向?yàn)樯仙磻?yīng)。線性范圍為10 ～9000 μmol/L。取空白/校準(zhǔn)品/標(biāo)本 6 μL，加入肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、過氧化氫酶及 ESPMT混合物180 μL，混勻，37℃孵育5 min，測(cè)定吸光度(A1)值;再加入肌酐胺基水解酶、過氧化物酶及4-氨基安替比林(4-APP)的混合物 60 μL，混勻，37 ℃孵育 5 min后，測(cè)定A2值，計(jì)算A值的差值ΔA(ΔA=[(A2－A1)校準(zhǔn)品管或標(biāo)本管－ (A2－A1)空白管]。

3.Jaffe法 采用邁瑞B(yǎng)S-800M全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，波長(zhǎng)510 nm，溫度37℃，采用固定時(shí)間法分析類型，反應(yīng)方向?yàn)樯仙磻?yīng)。線性范圍為 9 ～2420 μmol/L。取空白/校準(zhǔn)品/標(biāo)本18 μL，加入 0.38 mol/L NaOH 180 μL，混勻，37℃孵育 1 min;再加入 15 mmol/L苦味酸180 μL，混勻，37 ℃孵育30 s后，連續(xù)測(cè)定2 min內(nèi)的A值，計(jì)算變化率(ΔA/min=ΔA/min標(biāo)本管－ΔA/min空白管)。

三、標(biāo)本來源

收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院門診及住院患者血清標(biāo)本共200例，其中男82例、女118例，排除明顯溶血和脂濁的標(biāo)本。同時(shí)收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院門診、體檢中心及住院患者的臨床檢驗(yàn)剩余標(biāo)本，選擇明顯溶血標(biāo)本50例、高脂標(biāo)本(甘油三酯1.88～17.6 mmol/L)50例作為干擾標(biāo)本。收集臨床男、女性正常血清標(biāo)本各1份，分別添加50和100 μmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)品，用于精密度和回收率試驗(yàn)。所有血清標(biāo)本收集后置－70℃保存。

四、精密度及回收率試驗(yàn)

按美國臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案(CLIA'88)的要求觀察3種方法的精密度。批內(nèi)精密度:一次性同時(shí)測(cè)定20次;批間精密度:每天2批，每批2個(gè)濃度，每個(gè)濃度檢測(cè)2次，連續(xù)測(cè)定10批。精密度以變異系數(shù)(CV)表示[CV(%)=重復(fù)測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差/均值 ×100]。添加50和100 μmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)品的正常血清標(biāo)本和未添加肌酐標(biāo)準(zhǔn)品的正常血清標(biāo)本分別用 ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法重復(fù)測(cè)定6次，觀察方法的回收率?；厥章?%)=(添加標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本的血清肌酐濃度－未添加標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本的血清肌酐濃度)/標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度×100。

五、干擾試驗(yàn)

分別用 ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法測(cè)定溶血標(biāo)本、高脂標(biāo)本的肌酐濃度，計(jì)算酶法和Jaffe法與 ID-LC-MS/MS的相對(duì)偏差。方法偏差(Bias%)=(方法1測(cè)定值－方法2測(cè)定值)/[(方法1測(cè)定值+方法2測(cè)定值)/2]×100?？疾烊苎椭獙?duì)3種方法檢測(cè)肌酐的影響。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行，方法之間的差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)和方差分析，方法相關(guān)性采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精密度及回收率

3種方法重復(fù)測(cè)定血清肌酐的批內(nèi)、批間精密度及回收率結(jié)果見表1。3種方法的批內(nèi)、批間CV均＜5%，回收率由高到低依次為ID-LC-MS/MS＞酶法＞Jaffe法，無論添加50還是100 μmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)品，3種方法回收率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.005)。

二、相關(guān)性和偏差

采用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法分別測(cè)定200例臨床血清標(biāo)本肌酐濃度，經(jīng)線性回歸分析，方法間的回歸方程分別為Y酶法=0.964XID-LC-MS/MS+0.385，r=0.994;YJaffe法=0.955XID-LC-MS/MS+13.14，r=0.979。ID-LC-MS/MS 與酶法、Jaffe 法的線性相關(guān)圖見圖1。

表1 ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法測(cè)定血清肌酐的精密度及回收率 (%)

圖1 ID-LC-MS/MS與酶法、Jaffe法的線性相關(guān)圖

對(duì)ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法檢測(cè)200例血清標(biāo)本肌酐濃度進(jìn)行方法之間的一致性分析。以2種方法的肌酐測(cè)定均值為橫坐標(biāo)，以2種方法肌酐測(cè)量值百分偏差為縱坐標(biāo)，做Bland-Altman圖分析酶法、Jaffe法與ID-LC-MS/MS的測(cè)定差異，見圖2。酶法與ID-LC-MS/MS的平均偏差為 －2.93%，偏差幅度在 －26.2% ～21.2%之間波動(dòng);測(cè)定偏差有濃度依賴關(guān)系，當(dāng)肌酐濃度＞100 μmol/L時(shí)酶法的測(cè)定結(jié)果正負(fù)偏差和波動(dòng)幅度明顯減小(相對(duì)偏差為 －8.3% ～2.4%)。Jaffe法與ID-LC-MS/MS的平均偏差為13.9%，偏差幅度在－12.6% ～35.5%之間波動(dòng)。與IDLC-MS/MS相比，肌酐 ＜100 μmol/L時(shí) Jaffe法的結(jié)果呈現(xiàn)明顯正偏差;肌酐＞100 μmol/L時(shí)Jaffe法結(jié)果與ID-LC-MS/MS基本趨于一致(相對(duì)偏差為 －3.7% ～14.6%)。從圖2可以看出酶法與ID-LC-MS/MS的肌酐測(cè)定結(jié)果總體上呈現(xiàn)較小的負(fù)偏差，而Jaffe法與ID-LC-MS/MS的肌酐測(cè)定結(jié)果呈明顯正偏差。

三、干擾試驗(yàn)

同時(shí)用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法測(cè)定高脂標(biāo)本的血清肌酐濃度。結(jié)果顯示高脂可明顯干擾酶法及Jaffe法測(cè)定血清肌酐的準(zhǔn)確性。與IDLC-MS/MS相比，酶法及Jaffe法的測(cè)定結(jié)果均出現(xiàn)負(fù)偏差，見圖3;酶法的平均百分偏差為－10.9%(－22.1% ～ 13.7%)，Jaffe 法 為－17.5%(－71.1% ～16.1%)。高脂對(duì) Jaffe法的影響比酶法更大，其中有4份甘油三酯 ＞7.0 mmol/L的標(biāo)本肌酐測(cè)定結(jié)果甚至出現(xiàn)負(fù)值。隨著甘油三酯濃度的增高，測(cè)定負(fù)偏差趨勢(shì)越明顯。

同時(shí)用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法測(cè)定明顯溶血標(biāo)本的肌酐濃度。與ID-LC-MS/MS比較，酶法測(cè)定溶血標(biāo)本肌酐濃度的相對(duì)偏差均值為－9.1%(－18.0% ～11.7%)，Jaffe法的相對(duì)偏差均值為 －4.7%(－22.0% ～20.0%)。

高脂、溶血對(duì)酶法和Jaffe法測(cè)定肌酐產(chǎn)生明顯的負(fù)偏差，其百分偏差與正常標(biāo)本比較有明顯差異(P ＜0.001)，見圖4。

圖2 ID-LC-MS/MS與酶法、Jaffe法的Bland-Altman圖

圖3 甘油三酯濃度與酶法-ID-LC-MS/MS、Jaffe法-ID-LC-MS/MS測(cè)定肌酐百分偏差的關(guān)系

圖4 正常標(biāo)本、高脂標(biāo)本和溶血標(biāo)本肌酐測(cè)定偏差比較

討 論

隨著臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)標(biāo)本量的不斷增加，用于臨床檢驗(yàn)的各種儀器和方法也越來越多。而不同方法之間是否具有可比性，不同醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果能否互認(rèn)仍然是擺在我國臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)面前的現(xiàn)實(shí)難題[10]。而進(jìn)行方法比對(duì)試驗(yàn)，特別是與參考標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)，是實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果一致性的重要途徑[11]。目前臨床測(cè)定血清肌酐的常用方法為酶法和Jaffe法，有很多報(bào)道表明2種方法測(cè)定肌酐存在差異[1，3，12]。同位素稀釋質(zhì)譜法利用在標(biāo)本中添加與肌酐結(jié)構(gòu)相同的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，標(biāo)本處理后經(jīng)液相色譜儀分離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜選擇肌酐的母離子和子離子，檢測(cè)離子信號(hào)。本研究采用自建的ID-LC-MS/MS，在方法學(xué)全面驗(yàn)證之后，對(duì)ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法血清肌酐檢測(cè)結(jié)果的可比性進(jìn)行分析，為臨床實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)系統(tǒng)肌酐檢測(cè)結(jié)果的一致性提供參考。建立和應(yīng)用參考方法是臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的有效途徑，參考方法經(jīng)過了嚴(yán)格的溯源和驗(yàn)證，具有最高的計(jì)量學(xué)溯源性和準(zhǔn)確性。但是參考方法對(duì)儀器設(shè)備和分析條件的要求較高，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)，應(yīng)用范圍窄。與國際推薦的參考方法相比，本研究自建的ID-LC-MS/MS在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行了評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，并與常規(guī)方法進(jìn)行了比較，簡(jiǎn)便性和適用性是其突出特點(diǎn)。

酶法測(cè)定血清肌酐具有良好的精密度，批內(nèi)、批間 CV均 ＜1.14%，Jaffe法的 CV可控制在2.39%以內(nèi)。相對(duì)酶法和Jaffe法，ID-LC-MS/MS需要進(jìn)行標(biāo)本前處理，但CV可控制在3.84%以內(nèi)。可見3種方法分析精密度完全滿足臨床血清肌酐檢測(cè)的要求。在正常血清中添加2個(gè)濃度水平的肌酐標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定肌酐的回收率，平均回收率由高到低分別為ID-LC-MS/MS＞酶法＞Jaffe法，表明ID-LC-MS/MS在降低基質(zhì)干擾、提高分析準(zhǔn)確性上優(yōu)于其他2種方法。

總體而言，酶法、Jaffe法肌酐結(jié)果與ID-LCMS/MS具有良好的相關(guān)性。從相關(guān)系數(shù)和線性斜率上看，酶法與ID-LC-MS/MS的相關(guān)性要優(yōu)于Jaffe法與ID-LC-MS/MS的相關(guān)性。除個(gè)別低濃度標(biāo)本外，酶法與ID-LC-MS/MS具有較好的一致性，而 Jaffe法對(duì) ID-LC-MS/MS的截距為13.14 μmol/L，呈明顯的正偏差，主要集中在低濃度區(qū)域(肌酐＜100 μmol/L)。究其原因可能還是存在特異性的問題，血清基質(zhì)中某些物質(zhì)干擾Jaffe法肌酐的檢測(cè)。雖然ID-LC-MS/MS的線性范圍為4.4 ～885.0 μmol/L，比酶法和 Jaffe 法窄，仍可覆蓋臨床上所有正常人的血清肌酐以及絕大多數(shù)病理狀態(tài)(如尿毒癥)下的血清肌酐濃度范圍。本研究收集了200例臨床標(biāo)本，血清肌酐范圍為31 ～365 μmol/L，在 ID-LC-MS/MS 的線性范圍內(nèi)，因此3種方法的比較基本反映了真實(shí)情況。

酶法和Jaffe法測(cè)定肌酐均為間接檢測(cè)法，易受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，而Jaffe法的抗干擾能力更弱[3-4]。ID-LC-MS/MS為直接檢測(cè)法，由于經(jīng)過標(biāo)本凈化處理和液相色譜分離步驟，可以最大限度地避免與干擾物共流出，減少標(biāo)本基質(zhì)效應(yīng)，再由串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)肌酐的母離子和碎片離子，具有極高的檢測(cè)特異性和抗干擾能力。采用同位素稀釋法可以最大程度地減少分析過程中的損失和誤差，具有極高的檢測(cè)準(zhǔn)確性。因此ID-LC-MS/MS常被推薦作為臨床肌酐參考測(cè)量方法[7-8，13]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂和溶血對(duì)酶法和Jaffe法肌酐測(cè)定有明顯干擾，影響肌酐測(cè)定的準(zhǔn)確性。與IDLC-MS/MS相比，高脂、溶血對(duì)酶法和Jaffe法的肌酐測(cè)定產(chǎn)生明顯負(fù)偏差。高脂可使Jaffe法的肌酐測(cè)定偏差明顯增大。因此在臨床常規(guī)檢驗(yàn)中，采用Jaffe法或者酶法檢測(cè)肌酐，若發(fā)現(xiàn)標(biāo)本為高脂或溶血狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎對(duì)待檢測(cè)結(jié)果。如有條件，建議用ID-LC-MS/MS復(fù)核可疑數(shù)據(jù)。

總之，ID-LC-MS/MS測(cè)定血清肌酐在準(zhǔn)確性和抗干擾能力方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。酶法與同位素稀釋質(zhì)譜法的血清肌酐測(cè)定結(jié)果具有較好的可比性，受干擾影響小。Jaffe法的血清肌酐測(cè)定結(jié)果則存在較大偏差，更加易受干擾影響。

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