魯?shù)?，Azimova Bahtigul Jovliqizi，張國(guó)林，王 飛*

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049;3烏茲別克斯坦科學(xué)院生物化學(xué)研究所，塔什干 10012，烏茲別克斯坦

雌激素是人體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性物質(zhì)，介導(dǎo)了許多重要的生理功能。雌激素主要有三類(lèi)，活性最高的是雌二醇(17β-estradiol，E2)，其次是雌酮(estrone，E1)，活性最低的為雌三醇(estriol，E3)，其生物學(xué)效應(yīng)主要通過(guò)與雌激素受體(estrogen receptor α/β)相結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄活性，在生殖、免疫、骨骼、心血管和中樞神經(jīng)統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。雌激素缺乏常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、冠心病、阿爾茨海默癥、肥胖等常見(jiàn)疾病，而雌激素相對(duì)過(guò)量則是諸多腫瘤(如乳腺癌)發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等的直接原因［1］。生物體內(nèi)，膽固醇通過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成雌激素，其限速步驟是由芳香化酶催化雄激素底物轉(zhuǎn)化為雌激素。芳香化酶在卵巢、脂肪組織及骨骼中均有表達(dá)，但在不同組織中使用不同啟動(dòng)子，其調(diào)控機(jī)制也不一樣［2］。

在我國(guó)，隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近十年來(lái)，許多老年性疾病(如心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松癥及乳腺癌)的發(fā)病率、死亡率和危險(xiǎn)因素呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)。例如，由骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的脊柱或胯骨骨折是老年人發(fā)病和死亡的一個(gè)主要原因［3］。乳腺癌已經(jīng)是患病率最高的婦女惡性腫瘤，嚴(yán)重影響絕經(jīng)后婦女的生活質(zhì)量［4］。這些疾病的發(fā)生都與雌激素在機(jī)體內(nèi)的合成代謝紊亂和/或其介導(dǎo)的信號(hào)途徑失調(diào)有關(guān)，因此發(fā)現(xiàn)新的雌激素合成調(diào)節(jié)劑對(duì)于這些重大疾病的治療具有重要意義。但目前受限于小分子化合物的檢測(cè)方法，針對(duì)雌激素合成的化合物篩選進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重限制了具有組織特異性的雌激素合成調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)。對(duì)于雌二醇的檢測(cè)分析，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究工作，建立了諸如TLC、GC/MS、HPLC等理化分析方法［5］。但這些方法操作比較繁瑣，不適用于大量樣本的篩選工作［6］。目前常用方法是以同位素標(biāo)記的睪酮或雄烯二酮為底物，使用人胎盤(pán)微粒體或人重組芳香化酶蛋白［7］，或使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如表達(dá)芳香化酶的人JEG-3或JAr細(xì)胞系)，通過(guò)測(cè)量3H-水釋放量，從而確定芳香化酶活性［8］。同位素方法的優(yōu)點(diǎn)是所測(cè)結(jié)果可靠，檢測(cè)靈敏度高;缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，需要專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和條件，成本高，難以做到高通量篩選。人卵巢顆粒細(xì)胞KGN細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)表達(dá)較高水平的芳香化酶，由于缺乏17α-羥化酶，其本身并不產(chǎn)生睪酮或雌激素，且促卵泡激素(FSH)和福斯克林(Forskolin)可顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)芳香化酶表達(dá)，是進(jìn)行雌激素合成研究的良好細(xì)胞［9，10］。采用非放射性雌激素ELISA方法，能有效地檢測(cè)出KGN細(xì)胞芳香化酶活性變化［9，10］，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，適合大批量樣品檢測(cè)［11］。但這種基于聚苯乙烯基質(zhì)的酶聯(lián)免疫法的抗體與聚苯乙烯材料是疏水性非特異性結(jié)合的，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低，重復(fù)性不好。而磁微粒分離酶聯(lián)免疫法具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如磁微粒尺寸小、表面積大，共價(jià)交聯(lián)結(jié)合抗體，增加了抗原-抗體反應(yīng)的效率，降低非特異性結(jié)合，檢測(cè)更快速，更精確［12，13］。

雖然磁微粒分離免疫法已用于檢測(cè)環(huán)境污染物中的雌激素［14，15］，但該方法在基于細(xì)胞的雌激素活性評(píng)價(jià)和篩選方面的應(yīng)用尚有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)比較傳統(tǒng)的聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法和磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)靈敏度和特異性差異，確定KGN細(xì)胞系的培養(yǎng)條件、底物睪酮處理濃度等因素，構(gòu)建雌激素活性檢測(cè)的篩選模型。

1 材料和方法

1.1 材料

睪酮(T)、福美司坦(FOR)及福斯克林(FSK)買(mǎi)自 sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)。睪酮、福美司坦及福斯克林用DMSO溶解稀釋?zhuān)涑山K濃度為100 mmol/L的原始溶液，存放在-20℃。化合物溶液用DMSO依次梯度稀釋10倍。DMSO在培養(yǎng)基中的最終濃度為0.1%(v/v)。新生小牛血清、胎牛血清及活性炭/葡聚糖處理去除內(nèi)源性激素的新生小牛血清買(mǎi)自 GIBCO公司。有、無(wú)酚紅的DMEM/F-12培養(yǎng)基買(mǎi)自Invitrogen公司。青鏈霉素、PBS及含EDTA的胰酶買(mǎi)自成都哈里生物公司。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒買(mǎi)自上海Bestbio公司。

1.2 試劑盒

基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的Ekozyme人雌二醇ELISA診斷試劑盒，北京，倍愛(ài)康生物技術(shù)有限公司?；诰郾揭蚁┗|(zhì)酶聯(lián)免疫法的Cussabio人雌二醇ELISA試劑盒，武漢，華美生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

KGN細(xì)胞系(解放軍總醫(yī)院，母義明教授提供，中國(guó)北京)在補(bǔ)充有5%(v/v)胎牛血清(GIBCO，Invitrogen)，青霉素(100單位/mL)及鏈霉素(0.1 g/L)的 DMEM/F-12 培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 芳香化酶活性檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)［10］并作適當(dāng)修改，3×104KGN細(xì)胞/ml接種在24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基更換成不含血清的、DMEM/F-12培養(yǎng)基，加入不同濃度測(cè)試化合物，培養(yǎng)24 h。加入底物睪酮，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)基及去除培養(yǎng)基后裂解細(xì)胞所得溶液存于-20℃。培養(yǎng)基13000 rpm，離心1 min，使培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片等沉淀，獲得培養(yǎng)基上清液。用雌二醇檢測(cè)試劑盒定量培養(yǎng)基上清液中雌二醇量。所得結(jié)果經(jīng)蛋白校正，表示為對(duì)照DMSO的百分?jǐn)?shù)。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量裂解細(xì)胞所得溶液的蛋白含量。

1.4.2 檢測(cè)方法

按各種試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用Thermo Scientific Verioskan Flash多功能讀數(shù)儀檢測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法與磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的底物特異性研究

以KGN細(xì)胞系為研究對(duì)象檢測(cè)雌二醇合成變化需要以睪酮為底物，而睪酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌二醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。因此，為了研究聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法與磁微粒分離酶聯(lián)免疫法在雌二醇檢測(cè)中的特異性，我們檢測(cè)了這兩種試劑盒與底物睪酮的交叉反應(yīng)。表1表明，這兩種酶聯(lián)免疫法的交叉反應(yīng)都較低，睪酮幾乎不影響雌二醇檢測(cè)。即，基于聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法的ELISA試劑盒與基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的ELISA試劑盒的特異性都較高。

表1 雌二醇檢測(cè)法的交叉反應(yīng)率Table 1 The cross-reactivity of polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods(%)

2.2 聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法與磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的靈敏度研究

為了確定聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法與磁微粒分離酶聯(lián)免疫法雌二醇檢測(cè)靈敏度，使用這兩種ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)DMSO、10 μmol/L福斯克林及50 μmol/L福美司坦處理KGN細(xì)胞系后芳香化酶活性變化情況［16-18］。圖1表明，同種處理?xiàng)l件，磁微粒分離酶聯(lián)免疫法檢測(cè)到更高的雌二醇量，芳香化酶活性變化更顯著。上述結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法相比，磁微粒分離酶聯(lián)免疫法靈敏度更高，更適合于雌二醇檢測(cè)。

圖1 雌二醇檢測(cè)方法比較Fig.1 The sensitivity comparison of polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods

2.3 酚紅對(duì)雌二醇檢測(cè)的影響

培養(yǎng)基所含的酚紅用于指示培養(yǎng)基中CO2濃度變化，其顏色是粉紅色。為了確定酚紅顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，我們用聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法(OD450)和磁微粒分離酶聯(lián)免疫法(OD550)測(cè)量PBS溶液及酚紅溶液的吸光度值，圖2表明，兩種雌二醇檢測(cè)方法中，酚紅溶液在檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光度值都顯著大于PBS在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處的吸光度值。上述結(jié)果表明，由于酚紅顏色干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果比真實(shí)結(jié)果更大。因此，應(yīng)用不含酚紅的DMEM/F-12培養(yǎng)基接種KGN細(xì)胞系。

圖2 酚紅對(duì)雌二醇檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.2 The effect of phenol red in the culture medium on quantification of 17β-estradiol in polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods

2.4 最適睪酮處理終濃度的研究

為了優(yōu)化檢測(cè)體系的靈敏度，我們用基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的ELISA試劑盒檢測(cè)底物睪酮與產(chǎn)物雌二醇間的濃度關(guān)系。圖3表明，當(dāng)?shù)孜锊G酮終濃度為10 nmol/L時(shí)，與DMSO相比，50 μmol/L福美司坦抑制了22%的芳香化酶活性，而10 μmol/L福斯克林增加了300%的雌二醇量。而其它睪酮處理濃度條件下，福斯克林或福美司坦激活或抑制芳香化酶活性的能力不顯著。這可能因?yàn)椋诖盼⒘７蛛x酶聯(lián)免疫法的雌二醇ELISA試劑盒測(cè)量范圍為0～11 nmol/L，底物睪酮處理終濃度過(guò)大，造成培養(yǎng)基中雌二醇量超過(guò)該方法的檢測(cè)極限。上述結(jié)果表明，底物睪酮處理終濃度為10 nmol/L時(shí)，基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的ELISA試劑盒具有最佳檢測(cè)靈敏度。

圖3 睪酮濃度對(duì)雌二醇合成檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.3 The effect of testosterone concentration on quantification of 17β-estradiol in magnetic particle-based 17βestradiol assay methods

2.5 篩選模型有效性研究

為了確定基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)體系有效性，我們檢測(cè)底物睪酮終濃度為10 nmol/L時(shí)，不同濃度芳香化酶抑制劑及激動(dòng)劑對(duì)KGN細(xì)胞系雌激素合成的影響。如圖4所示，與不加底物睪酮相比，加入睪酮使培養(yǎng)基中雌二醇量增加了9倍，表明KGN細(xì)胞系有內(nèi)源性芳香化酶蛋白表達(dá)。與加入睪酮處理的相比，加入不同濃度(1-10 μmol/L)陽(yáng)性對(duì)照福斯克林，培養(yǎng)基中雌二醇生成量以濃度依賴(lài)方式增加，其中10 μmol/L福斯克林誘導(dǎo)培養(yǎng)基中雌二醇量增加了4.2倍左右。加入不同濃度(1～50 μmol/L)芳香化酶抑制劑福美司坦，雌二醇合成量以濃度依賴(lài)方式被抑制，其中50 μmol/L福美司坦抑制了30%左右的雌二醇合成量。以上結(jié)果表明我們成功建立雌激素篩選模型，可用于篩選雌激素合成調(diào)節(jié)劑。

圖4 KGN細(xì)胞系篩選模型有效性驗(yàn)證Fig.4 The validation of the screen platform in human KGN cells

3 結(jié)論

通過(guò)比較傳統(tǒng)基于聚苯乙烯基質(zhì)的酶聯(lián)免疫法及磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)特異性及靈敏度，我們發(fā)現(xiàn)，雖然聚苯乙烯酶聯(lián)免疫法與磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)特異性差別不大，但磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的靈敏度更高，更適合于雌二醇檢測(cè)。通過(guò)進(jìn)行酚紅對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響及底物睪酮處理終濃度的研究發(fā)現(xiàn)，酚紅顏色干擾導(dǎo)致磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)結(jié)果變大，磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的最適底物睪酮處理終濃度為10 nmol/L。通過(guò)檢測(cè)篩選模型有效性確定所構(gòu)建的雌激素篩選模型，即在24孔組織培養(yǎng)板中，使用不含酚紅、含5%活性炭/葡聚糖處理去除內(nèi)源性激素的新生小牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基接種3×104KGN細(xì)胞/ml，培養(yǎng)24 h。加測(cè)試物處理KGN細(xì)胞系前，培養(yǎng)基更換成不含酚紅、不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基;24小時(shí)后，加入終濃度為10 nmol/L底物睪酮，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用基于磁微粒分離酶聯(lián)免疫法的雌二醇ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中雌二醇量。所建立的篩選模型避免采用放射性底物，環(huán)境友好，成本較低，適用于基于細(xì)胞的雌激素生物合成活性評(píng)價(jià)和高通量篩選，對(duì)篩選和發(fā)現(xiàn)具有組織特異性的雌激素合成調(diào)節(jié)劑具有重要意義。

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