史高峰，王紅玉，陳學福，王國英，宮建輝

蘭州理工大學石油化工學院，蘭州 730050

甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)屬菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西［1］，是目前已知甜度較高的糖料植物之一。甜葉菊性味甘、平，不僅富含甜菊糖苷，還含有甾醇類和黃酮類成分［2］。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗肌瘤、抗氧化、抗自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛和保肝等活性［3］。甜葉菊中的黃酮類化合物具有良好的降糖降壓降脂的生物活性［4］。目前關于甜葉菊黃酮類化合物的研究尚不充分，尤其是在甜葉菊黃酮的分離純化方面，報道很少，而大孔吸附樹脂是近十幾年發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，近年來已廣泛用于植物有效成分的分離純化，如分離純化皂苷、黃酮、生物堿等［5-7］。因此，本研究對大孔吸附樹脂及溶劑萃取法分離純化甜葉菊總黃酮進行初步的研究，探索適宜的純化條件，為甜葉菊葉活性成分的研究提供新的實驗依據(jù)，為合理開發(fā)甜葉菊資源提供必要的科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

甜葉菊(甘肅酒泉)經(jīng)蘭州大學藥學系馬志忠教授鑒定;蘆丁標準品(純度≥92.5%)，中國藥品生物制品檢定所;D101、NKA-9、AB-8型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司);實驗室自制蒸餾水、甲醇(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)。

1.2 儀器與設備

U-2001紫外可見分光光度計(Hitachi，Ltd.，日本東京);AL204電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］;SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(天津華鑫儀器廠);RE-3000旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱(揚州鴻都電子有限公司);EQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取5 mg蘆丁標準品，甲醇超聲溶解于25 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得到濃度為0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0.2、0.6、1.0、1.4、2.2、3.0 mL 分別置于 10 mL 的容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL，用無水甲醇定容，搖勻，此時溶液顏色變?yōu)槌燃t色，放置15 min，以甲醇作空白，在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，蘆丁標準溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標繪制標準曲線。其線性回歸方程為:A=8．8051C-0．0042，R2=0.9997 ［A 為吸光度，C為總黃酮質量濃度/(mg/mL)］。結果表明，在蘆丁質量濃度為0.004～0.060 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 甜葉菊總黃酮粗提物的制備

稱取甜葉菊渣100 g，在乙醇體積濃度80%、提取時間2.5 h、料液比1∶20(g/mL)、溫度80℃的條件下回流提取3次，合并提取液真空濃縮至無醇味，干燥得粗黃酮浸膏，純度為20.56%，蒸餾水超聲溶解配制1.2 mg/mL的總黃酮樣液，4℃冷藏備用。

2.3 大孔樹脂的預處理

分別稱取適量的AB-8、D101、NKA-9三種樹脂，用體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹和初步除雜，用濕法裝柱，繼續(xù)用95%的乙醇以適當流速通過柱子，用乙醇洗滌至流出液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象后，再用蒸餾水洗凈乙醇。然后用5%HCl溶液浸泡3 h后蒸餾水洗至中性，再用4%NaOH溶液浸泡3 h后蒸餾水洗至中性，用蒸餾水浸泡備用［8］。

2.4 大孔吸附樹脂類型的篩選

2.4.1 大孔樹脂吸附率和解吸率的測定

本實驗選取AB-8、D101、NKA-9三種不同型號的大孔吸附樹脂對甜葉菊黃酮粗提液進行處理，探討適合甜葉菊黃酮的最優(yōu)樹脂。分別取預處理好三種大孔吸附樹脂各5.0 g，分別置于250 mL錐形瓶中，各加入總黃酮溶液(濃度1.2 mg/mL)50 mL，塞上塞子，120 rpm、30℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后抽濾，測定濾液中黃酮質量濃度，計算各樹脂吸附率。將吸附飽和的大孔樹脂加蒸餾水洗至糖的Molish反應為陰性，再用70%乙醇50 mL，120 rpm、30℃恒溫振蕩24 h，抽濾，收集濾液測定濾液中的黃酮質量濃度，計算各樹脂的解吸率。

C0:吸附前樣品液中總黃酮質量濃度mg/mL;V0:吸附前樣液體積mL;

C1:吸附后殘液中總黃酮質量濃度mg/mL;V1:吸附后殘液體積mL;

C2:解吸液中總黃酮質量濃度mg/mL;V2:解吸液體積mL;

M1:黃酮質量;M:浸膏質量;

2.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學特性測定

進行靜態(tài)吸附動力學測定，進一步篩選最佳樹脂。準確稱取處理好的樹脂5.0 g，用濾紙吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，加入質量濃度為1.2 mg/mL黃酮提取液50 mL，120 rpm、30℃恒溫振蕩吸附，每隔1 h取樣1 mL，測定其黃酮質量濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線［9］。

2.4.3 大孔樹脂的動態(tài)吸附實驗

由篩選實驗篩選出一種理想大孔吸附樹脂，稱取15 g已經(jīng)預處理的最佳樹脂，濕法裝入1.5×25 cm層析柱中，考察上樣流速、上樣液質量濃度、上樣液pH值、上樣量、解吸液體積濃度、用量以及流速等進行動態(tài)吸附及解吸實驗，確定最佳工藝條件。

2.5 溶劑萃取法純化總黃酮

通過研究溶劑種類、萃取溫度、萃取次數(shù)3個單因素對大孔樹脂純化后總黃酮純度的影響，篩選出溶劑萃取法的最佳工藝條件。

3 結果與分析

3.1 大孔樹脂的篩選

3.1.1 3種大孔樹脂吸附量與解吸率

如表1所示，雖然AB-8和D101大孔樹脂的解吸率差不多，卻明顯高于NKA-9，而且AB-8的吸附率高于D101和 NKA-9，實驗中選擇AB-8和 D101這2種樹脂通過靜態(tài)吸附動力學曲線進行進一步篩選。

表1 3種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸Table 1 Static adsorption rates and desorption rates of three types of macroporous resins

3.1.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線

在樹脂靜態(tài)吸附過程中，吸附動力學曲線反映了吸附量與吸附時間之間的關系。流出液中黃酮的濃度越大就說明吸附量越小，從圖1看出，大孔吸附樹脂AB-8、D101在4 h以內(nèi)流出液黃酮濃度波動較大，呈下降趨勢，即吸附量波動較大，呈上升趨勢;5 h后趨勢變緩，2種樹脂對甜葉菊總黃酮的吸附飽和時間都在5 h左右，但從總體上來看AB-8吸附量始終優(yōu)于D101，故選取AB-8進行產(chǎn)品純化。

3.2 大孔樹脂對黃酮的動態(tài)吸附與解吸

3.2.1 上樣流速對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液50 mL(1.2 mg/mL)，以不同的流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計算吸附率。結果如圖2所示，吸附率隨上樣流速增大而降低，流速在1 mL/min～2 mL/min時，下降趨勢小;在2 mL/min～4 mL/min時下降趨勢明顯較大。其原因可能是流速較慢時提取液與樹脂接觸的時間較長，有利于黃酮類物質從液相擴散到樹脂內(nèi)部，從而提高了吸附率［10］。因此，為了節(jié)省時間，選擇上樣流速為2 mL/min。

3.2.2 上樣液質量濃度對AB-8吸附的影響

將甜葉菊黃酮溶液稀釋成0.38、0.75、1.20、1.50、1.93、2.50 mg/mL 等不同濃度的上樣液，各50 mL，以2 mL/min的流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計算吸附率。結果如圖3所示，當樣液濃度小于1.5 mg/mL時，隨著樣液濃度的增大，吸附率增大;當樣液濃度為1.5 mg/mL時，吸附率達到最大值;隨后，隨著樣液濃度的增大，吸附率減小。所以，并不是濃度越大吸附效果越好，藥液的澄清度也會影響樹脂的吸附效果，且如果樣品溶液濃度超過了樹脂吸附極限，黃酮類物質就會過早流出，導致吸附率降低。因此，選擇上樣液質量濃度為1.5 mg/mL。

3.2.3 上樣液pH值對AB-8吸附的影響

將濃度為1.5 mg/mL的甜葉菊總黃酮提取液分別調成 pH 2.5、3.5、4.5、5.5，以 2 mL/min 流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計算吸附率。由圖4可知，樣液的pH值對吸附率的影響較大。在pH 3.5時吸附率達到最大值，之后，隨著pH的增大，吸附率反而減小。這是由于黃酮類化合物具有多羥基酚結構，呈弱酸性，在酸性條件下呈分子狀態(tài)，以氫鍵方式被吸附，因而樹脂吸附量大，但若酸性過強，黃酮類化合物易生成烊鹽，使吸附效果變差。堿性增大則H質子易于被強堿俘獲，使酚羥基上的氫解離形成酸根離子，與樹脂的結合減弱從而使吸附量降低［11］。因而AB-8在弱酸性或酸性條件下對甜葉菊總黃酮吸附的效果較好。因此，上樣液pH值控制在3.5左右。

3.2.4 上樣量對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣，收集每1 BV的流出液，測定流出液中總黃酮濃度。結果如圖5所示，隨著上樣量的增大，流出液中總黃酮的濃度呈上趨勢。當上樣量達到4 BV時，黃酮濃度達到0.17 mg/mL，超過上樣濃度的10%，已達到泄漏點，因此，選擇上樣量為4 BV。

3.2.5 解吸液體積濃度對AB-8吸附及黃酮純度的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，分別用水、10%、30%、50%、70%、90%等不同體積分數(shù)的乙醇進行洗脫，解吸液為4 BV。測定解吸液中總黃酮濃度，計算解吸率及純度。結果如圖6所示，當乙醇濃度小于50%時，解吸率和黃酮純度都隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大，50%乙醇解吸率最大，當乙醇體積分數(shù)大于50%時，解吸率及純度都呈下降趨勢?？赡苁怯捎谝掖俭w積分數(shù)增大，醇溶性的雜質增多，降低了解吸率和總黃酮純度。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為50%。

3.2.6 解吸流速對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH 3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，分別用50%的乙醇溶液以1、1.5、2、2.5 mL/min的流速解吸。測定解吸液中總黃酮濃度，計算解吸率。結果如圖7所示，當解吸流速小于1.5 mL/min時，解吸率隨著解吸流速的增大而增大;解吸流速為1.5 mL/min時，解吸率達到最大值;解吸流速大于1.5 mL/min時，解吸率反而隨著解吸流速的增大而減小。這是由于解吸流速太慢時，解吸時間長、解吸的雜質多;流速太快時，解吸液與大孔樹脂接觸時間太短，導致解吸不完全。因此，選擇解吸流速為1.5 mL/min。

3.2.7 解吸液量對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，用50%的乙醇溶液以1.5 mL/min的流速解吸。收集每1 BV的解吸液，測定解吸液中黃酮濃度，計算解吸率。結果如圖8所示，在解吸量小于5 BV時，隨著解吸量的增大，解吸率急劇上升;解吸量大于5 BV時，解吸率變化不大，說明總黃酮已基本洗脫完全?？紤]到溶劑的消耗，因此，選擇解吸液量為5 BV。

3.2.8 動態(tài)吸附解吸驗證

準確稱取120 g經(jīng)預處理好的AB-8型大孔樹脂2份，裝入3 cm ×50 cm層析柱，在最佳工藝條件下初步分離純化甜葉菊渣中總黃酮。最佳工藝條件:上樣液質量濃度為1.5 mg/mL，上樣液pH 3.5，吸附流速為2 mL/min，上樣量為4 BV進行動態(tài)吸附。樹脂經(jīng)飽和吸附后，以蒸餾水洗脫至無色，除去水溶性的雜質。然后用50%的乙醇進行解吸，解吸流速為1.5 mL/min，收集5 BV的解吸液，真空濃縮，干燥得棕黃色的總黃酮粉末。用紫外分光光度法測得純化后的總黃酮純度為50.11%，約為純化前的2.5倍。

3.3 溶劑萃取法純化總黃酮

3.3.1 溶劑種類對甜葉菊總黃酮的影響

取AB-8大孔樹脂純化后的總黃酮0.1 g三份，蒸餾水超聲溶解于20 mL燒杯中，常溫下，分別用等體積的乙醚、乙酸乙酯、氯仿萃取總黃酮，萃取3次，合并有機相，回收溶劑，干燥得淡黃色的總黃酮粉末，測黃酮的得率及純度。結果如圖9所示，乙酸乙酯萃取總黃酮得率和純度均最高，乙醚萃取效果次之，氯仿萃取效果最差。原因可能是由于乙醚萃取的脂溶性成分較多，使活性物質黃酮溶出減少，降低了得率和純度，而氯仿由于極性太小，萃取出的黃酮少。故選擇乙酸乙酯為萃取溶劑。

圖9 溶劑種類的影響Fig.9 Effect of types of solvent

圖10 萃取溫度的影響Fig.10 Effect of extraction temperature

3.3.2 萃取溫度對甜葉菊總黃酮的影響

如3.3.1方法制備總黃酮樣液，用等體積的乙酸乙酯分別在30、40、50、60℃下萃取總黃酮，萃取3次，測黃酮的得率及純度。結果如圖10所示，隨著萃取溫度的升高，總黃酮得率升高，而純度卻降低了。原因是由于隨著溫度的升高，黃酮的溶解度增大，得率就高，但雜質的溶解度也增大了，所以就導致純度下降了?？紤]到升高溫度會增大溶劑的蒸發(fā)，浪費溶劑，還增加熱能的消耗，故選擇30℃，也就是常溫下萃取。

3.3.3 萃取次數(shù)對甜葉菊總黃酮的影響

如3.3.1方法制備總黃酮樣液，在常溫下，用等體積的乙酸乙酯萃取總黃酮，測每次萃取的總黃酮的得率及純度。結果如圖11所示，隨著萃取次數(shù)的增加，總黃酮得率呈上升趨勢，但當萃取次數(shù)達到5次時，總黃酮得率趨勢平緩，考慮到溶劑的浪費，故選擇萃取5次。

圖11 萃取次數(shù)的影響Fig.11 Effect of extraction times

3.3.4 溶劑萃取驗證

取三份初步純化的總黃酮，用乙酸乙酯在常溫條件下萃取5次，純度由50.11%上升到91.8%。

4 結論

AB-8型樹脂對甜葉菊總黃酮的吸附量大、吸附率高、易解吸，產(chǎn)品純度較高，是一種良好的黃酮吸附劑，適用于甜葉菊總黃酮的純化。最佳純化條件為:吸附流速2 mL/min、上樣液質量濃度1.5 mg/mL、上樣液pH 3.5、上樣量4 BV、解吸液為體積分數(shù)50%乙醇溶液，解吸流速1.5 mL/min、解吸量5 BV，經(jīng)處理后總黃酮純度為50.11%，約為純化前的2.5倍。后用乙酸乙酯在常溫條件下萃取5次，得到甜葉菊渣中總黃酮純度為91.8%。結果表明:通過AB-8大孔樹脂吸附和乙酸乙酯萃取相結合的方法，能很好的純化甜葉菊渣中總黃酮。

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