連昕 陳娟 馮愛平 曾敬思 鄭岳臣

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢 430022;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院超聲影像科，武漢 430022)

等離子體(Plasma)是氣體在加熱或強(qiáng)電磁場(chǎng)作用下電離產(chǎn)生的氣體云［1］。常壓等離子體是在非真空條件下獲得的，按照帶電粒子溫度的相對(duì)高低分為高溫和低溫等離子體，常壓低溫等離子體又稱為APNP(Atmospheric pressure non-equilibrium plasma，APNP)。它以射頻電容耦合的方式在大氣壓下產(chǎn)生，其溫度低，等離子體面積較大而均勻，產(chǎn)生的等離子體活性高，且對(duì)活體組織無損傷［2-3］。國內(nèi)外大量最新研究表明，等離子體有很強(qiáng)的殺滅微生物的作用，但對(duì)于其殺真菌效果、參數(shù)選擇和機(jī)制則研究較少。本文旨在通過觀察不同放電氣體、作用時(shí)間和作用距離的APNP對(duì)白念珠菌的殺滅效果及作用后菌體的超微結(jié)構(gòu)變化，初步了解其對(duì)真菌的殺滅作用、參數(shù)選擇及作用機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床消毒殺菌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌液制備

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株C1a，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科真菌室提供。凍干菌種融化后，復(fù)蘇劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿，至少傳代2次。取典型單菌落，以無菌生理鹽水稀釋，電動(dòng)混合器振蕩20 s，使真菌孢子懸浮均勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 APNP 噴流裝置

此裝置基于DBD(電介質(zhì)阻擋放電)，當(dāng)在進(jìn)氣口通入He/O2的混合氣體時(shí)，在噴嘴末端將產(chǎn)生羽毛狀的APNP噴流。實(shí)驗(yàn)中采用脈沖直流電源，放電電壓8 000 V，輸出頻率10 kHz，脈寬1 600 ns。

1.3 APNP噴流處理后白念珠菌生長情況觀察

取制備好的菌液，調(diào)整菌懸液濃度為1×105～1×106/mL。取無菌載玻片，吸取10 μL菌懸液均勻涂布并晾干。標(biāo)本分為1、2、3組，1組用于比較不同氣體流量的殺菌效果，2組用于比較不同作用距離的殺菌效果，3組用于比較不同作用時(shí)間處理后的殺菌效果。以上各組參數(shù)設(shè)置如表1所示，每不同參數(shù)小組均為5個(gè)載玻片標(biāo)本。處理后的5個(gè)載玻片標(biāo)本中，2個(gè)用于掃描電鏡和透射電鏡觀察，另外3個(gè)經(jīng)清洗后稀釋，并接種于沙氏培養(yǎng)基平皿，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況，并于培養(yǎng)72 h后采用平板計(jì)數(shù)法獲得處理后各標(biāo)本的菌落形成單位(Colony Forming U-nit，CFU)，計(jì)算3個(gè)標(biāo)本的平均值作為最終CFU。1.4 APNP噴流處理后白念珠菌超微結(jié)構(gòu)觀察

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組標(biāo)本分別經(jīng)日立S-570型掃描電鏡及FEI TEcnai G212型透射電鏡觀察并拍照。

表1 各實(shí)驗(yàn)組等離子體作用參數(shù)Tab.1 Action parameters of APNP flow for each experimental group

2 結(jié) 果

2.1 不同參數(shù)APNP噴流處理后白念珠菌生長情況

每24 h觀察菌落生長情況，共觀察72 h。等離子體處理24 h后，所有平皿中只有對(duì)照組長出細(xì)沙狀菌落;48 h后處理組可見稀疏菌落生長;72 h后平皿均出現(xiàn)奶酪樣乳白色菌落，處理組與對(duì)照組相比菌落明顯稀疏(見圖1)。

圖1 經(jīng)APNP處理的白念株菌標(biāo)本72 h后的生長情況:a.1-A組(對(duì)照組)，b.1-B 組，c.2-B 組Fig.1 Growth situation of Candida albicans strains，72 hours after managed with APNP

不同氣體流量的比較(1組):72 h后對(duì)照組菌落分布均勻，大小一致，處理組的平皿菌落稀疏，與對(duì)照組相比，菌落生長明顯被抑制。且隨著放電氣體中氧氣含量增加，抑制效果更加明顯。對(duì)菌落生長的抑制作用強(qiáng)弱依次為:He/O2流量2/0.06 L/min＞2/0.04 L/min＞2/0.02 L/min(見圖2a)。

不同作用距離的比較 (2組):在相同的氣體流量和作用時(shí)間下，隨著等離子體噴嘴與標(biāo)本間距離的減小，其作用后菌株生長抑制更加明顯(見圖2b)。

不同作用時(shí)間的比較 (3組):選擇氣體流量參數(shù) He/O2為2/0.06 L/min，作用距離為1 cm，作用時(shí)間分別為2 min、3.5 min、5 min 和 10 min。與對(duì)照組相比，處理組菌落稀疏，處理時(shí)間越長抑制作用越明顯。處理3.5 min后的標(biāo)本菌落生長即明顯被抑制，隨著時(shí)間的延長，菌落逐漸稀疏，作用10 min后標(biāo)本幾乎無菌生長。不加電壓，僅噴射He/O2氣體的標(biāo)本菌落生長情況與對(duì)照組無區(qū)別(見圖2c)。

圖2 APNP作用后72 h不同氣體流量 (a)、作用距離 (b)、作用時(shí)間(c)組白念珠菌CFUFig.2 CFU of Candida albicans strains，72 hours after managed with APNP of different gas flow(a)，operation distance(b)and action time(c)respectively

2.2 經(jīng)APNP處理后白念珠菌超微結(jié)構(gòu)改變

以3 組 (3-A、3-D、3-E、3-F 組)為例，掃描電鏡下對(duì)照組(3-A組)白念珠菌孢子形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁完整，輪廓清楚，大小形態(tài)正常，APNP作用后菌體結(jié)構(gòu)有明顯改變，等離子體作用3.5 min(3-D組)后菌體體積增大，細(xì)胞表面皺縮不平，細(xì)胞壁分層，細(xì)胞壁外膜有嚴(yán)重皺折、剝脫及裂痕;作用5 min(3-E組)的菌體損傷更加明顯，細(xì)胞壁裂痕明顯，且部分細(xì)胞干癟，提示細(xì)胞壁已破裂，細(xì)胞質(zhì)外漏;作用10 min(3-F組)的菌體胞壁呈碎片狀并伴有細(xì)胞質(zhì)的流出，菌體間出現(xiàn)融合現(xiàn)象，菌體間隔模糊，細(xì)胞形態(tài)難以辨認(rèn)(見圖3)。

透射電鏡下(見圖4)正常白念珠菌菌體形態(tài)完好，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞壁質(zhì)地致密，呈低電子密度的灰白色、厚薄均勻、規(guī)則，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)均勻(A);處理后細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞壁不完整、變薄，局部有缺損，部分在出芽部位缺損 (B)，質(zhì)地疏松，部分變成高電子密度的黑灰色 (B);細(xì)胞膜不完整。局部有缺損 (B);胞質(zhì)不均勻，電子密度低，胞內(nèi)物質(zhì)少，疏松 (B、D、E)，部分有空泡狀物及光亮區(qū)形成;核膜被破壞，核內(nèi)物質(zhì)散亂(F)，有核固縮現(xiàn)象 (C)。

3 討 論

真菌是廣泛分布于自然界的微生物，引起人類發(fā)病的大多為條件致病菌。隨著免疫缺陷、抑制人群的逐漸增多，深部及系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率和死亡率不斷上升，其感染早期診斷困難、治療棘手、預(yù)后不良，已經(jīng)成為血液病、器官移植、艾滋病及ICU患者的主要死因［4］。臨床上導(dǎo)致深部感染的最常見病原真菌為白念珠菌［5］，其廣泛存在于與人類密切接觸的室內(nèi)外環(huán)境中以及日常生活、醫(yī)療用品上，因此免疫缺陷患者所處的環(huán)境及所使用的醫(yī)療、生活用品均要求進(jìn)行嚴(yán)格的抗真菌處理。

隨著利用生物、光學(xué)、橡塑、光纖和晶體等材料的先進(jìn)醫(yī)療器械及醫(yī)用材料不斷出現(xiàn)，對(duì)這些材料，既不能用高溫高壓消毒處理，也不能簡(jiǎn)單地使用放射源、紫外或其他化學(xué)方法滅菌。理想的可用于臨床的低溫滅菌技術(shù)應(yīng)該具有以下一些特性［6］:①滅菌時(shí)間短，少于傳統(tǒng)的熱力滅菌法。②滅菌溫度低于50℃。③能夠滿足多種物體的滅菌需要。④滅菌過程對(duì)于操作人員、患者和被滅菌物體都應(yīng)是無害的。低溫等離子體滅菌法能滿足以上要求，并且在對(duì)物體進(jìn)行有效滅的情況下，對(duì)物體的損害最?。?］。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，APNP對(duì)于臨床常見致病真菌白念珠菌具有明顯的殺滅作用，且電鏡觀察發(fā)現(xiàn)處理后的白念珠菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外流，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)少、疏松，核膜被破壞、核內(nèi)物質(zhì)散亂。因此細(xì)胞壁破裂，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的損害可能是導(dǎo)致菌體死亡的原因。

等離子體主要由帶電粒子、紫外線及多種活性自由基組成，這些成分對(duì)微生物具有很強(qiáng)的殺滅作用。關(guān)于等離子體殺滅微生物的機(jī)理，Mendis［8］研究組指出帶電粒子可能在細(xì)胞外膜表面積累，產(chǎn)生超過細(xì)胞膜自身張力的靜電力，從而引起細(xì)胞破裂。而在本實(shí)驗(yàn)中，等離子體噴流裝置使受試菌體遠(yuǎn)離放電腔，當(dāng)氣體離開發(fā)生腔之后帶電粒子很快消失，因此帶電粒子使白念珠菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜破裂的可能性很小。另外，本實(shí)驗(yàn)所采用的等離子體噴流裝置產(chǎn)生的紫外線可以忽略不計(jì)，因此我們推測(cè)活性氧自由基是APNP殺菌作用的主要機(jī)制。Montie等［9］認(rèn)為是活性自由基導(dǎo)致了細(xì)胞外膜的破裂。Sharma等［10］則認(rèn)為等離子體中的活性氧自由基與細(xì)胞壁上的碳反應(yīng)，生成二氧化碳并揮發(fā)掉，從而破壞細(xì)胞壁，直接影響到核酸。Q.S.Yu等［11］利用常壓等離子體刷處理大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)He-O2混合氣等離子體失活微生物的效率比單純氦氣的更高，因此他們認(rèn)為氧活性成份在等離子體失活微生物過程中起重要作用。Lee等［12］亦通過等離子體殺滅真菌-釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其殺菌作用主要來自于活性氧自由基。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了不加電壓，只有氣吹的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該對(duì)照組與未經(jīng)任何處理的對(duì)照組無差別，說明氣吹在殺菌過程中不起作用。本實(shí)驗(yàn)中采用的放電氣體是He和少量的O2，在放電過程中，形成氦亞穩(wěn)粒子的幾率非常高，這些亞穩(wěn)粒子可以通過碰撞把能量轉(zhuǎn)移給通入的O2以及噴口處空氣中的O2或N2等氣體，通過一系列反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生 O* (活性氧原子)、O、O3、NO、NO2、OH等活性粒子。這些活性粒子可以同菌體細(xì)胞壁中某些物質(zhì)反應(yīng)生成二氧化碳和水等揮發(fā)性物質(zhì)，同時(shí)與細(xì)胞膜脂蛋白或細(xì)胞膜中的磷脂類、蛋白質(zhì)等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜受到破壞，造成局部缺損或通透性改變，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)改變，此外這些活性粒子還會(huì)迅速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，氧化細(xì)胞內(nèi)酶或RNA、DNA，導(dǎo)致菌體死亡。

圖3 等離子體處理后白念珠菌菌體結(jié)構(gòu)改變 (×10 000):a.3-A組，b.3-D組，c.3-E組，d.3-F組 圖4 正常對(duì)照標(biāo)本 (a)與等離子體處理 5 min 后標(biāo)本(b，c，d，e，f)透射電鏡觀察Fig.3 Structural modification of the Candida albicans strains after treated with APNP Fig.4 Normal control strain(a)compared with strains treated with APNP for 5 min(b，c，d，e，f)under transmission electron microscope

本實(shí)驗(yàn)中，等離子體對(duì)白念珠菌的殺滅作用與放電氣體中氧氣含量、處理時(shí)間、作用距離明顯相關(guān)。通入的放電氣體成分不同，等離子體中各種活性粒子的成分和比例就不同，滅菌效果相應(yīng)受到影響。本實(shí)驗(yàn)中，隨著O2含量的增加，殺菌效果亦更加明顯，說明了氧活性成份在等離子體殺滅微生物過程中起主要作用。另外，等離子體與標(biāo)本距離越小、作用時(shí)間越長殺菌效果越好，可見，與其他滅菌方法一樣，滅菌時(shí)間與作用距離也是影響殺菌效果的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)研究了APNP噴流對(duì)白念珠菌的殺菌效果，發(fā)現(xiàn)它能有效地殺滅白念珠菌，且其殺菌機(jī)制與活性氧成分破壞真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有關(guān)，但此發(fā)現(xiàn)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)予以證實(shí)。另外，APNP是否還存在除活性氧以外的殺菌機(jī)制，其對(duì)除白念珠菌以外的臨床常見致病真菌的殺菌效果如何，其用于臨床疾病治療的可行性等，還有待進(jìn)一步研究。低溫等離子體殺滅真菌的研究及應(yīng)用對(duì)于建立安全、簡(jiǎn)便、低溫且無殘留毒性的滅菌及治療方法具有重大意義，必將推動(dòng)滅菌技術(shù)及真菌感染性疾病臨床治療的發(fā)展。

致謝:感謝華中科技大學(xué)電氣與電子工程學(xué)院低溫等離子體實(shí)驗(yàn)室盧新培教授、熊紫蘭博士提供等離子體設(shè)備并給予技術(shù)支持。

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