周潔 潘煒華 廖萬(wàn)清

(上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

生物膜現(xiàn)象最早在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已證實(shí)許多致病真菌也可形成生物膜［1］。不同于細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)的概念，生物膜 (biofilm)是相對(duì)游離態(tài)而言的一種微生物存在形態(tài)，是大部分微生物在自然環(huán)境的主要存在形式，對(duì)于微生物而言是一種保護(hù)機(jī)制，能保護(hù)其免受抗生素的損害作用并能引起持續(xù)感染，故在臨床感染中有著重要意義［2］。臨床上大約有65%的感染與微生物在組織、器官或醫(yī)療設(shè)備表面形成生物薄膜有關(guān)［3-4］。由于體外模型的限制，對(duì)于新生隱球菌生物膜的研究一直停滯不前。我們利用SD大鼠體內(nèi)置管的方法構(gòu)建了新生隱球菌生物膜感染模型，便于開(kāi)展對(duì)于新生隱球菌在宿主體內(nèi)代謝水平、耐藥等一系列生物學(xué)活性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H99(血清型A型):由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心隱球菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基 酵母浸膏(YEPD)液體和SDA固體培養(yǎng)基，DMEM液體培養(yǎng)基(杭州四季青，中國(guó))。

藥物 注射用環(huán)磷酰胺(Sigma 218707，美國(guó))。主要試劑與器材 1%戊二醛磷酸鹽緩沖液，由上海復(fù)旦大學(xué)電鏡室提供;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，MTT(Sigma M5655，美國(guó));二甲亞砜，DMSO(Amersco 0464，美國(guó));小牛血清 (杭州四季青，中國(guó));24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國(guó));普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，掃描電子顯微鏡 (日立TM-1000，日本)，酶標(biāo)儀 (Beckman AD340，美國(guó))。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重約200 g的雌性SD大鼠10只(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，鼠齡3～4周，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各5只。其中，實(shí)驗(yàn)組大鼠按照50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺進(jìn)行免疫抑制，對(duì)照組僅給予腹腔注射相同容量的生理鹽水。

1.2 方法

菌懸液的制備 菌株于沙氏培養(yǎng)基中-70℃保存，在實(shí)驗(yàn)前1 d轉(zhuǎn)種于YEPD液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)1 d，再轉(zhuǎn)種于SDA固體培養(yǎng)基，35℃恒溫培養(yǎng)2 d。取單菌落5個(gè)稀釋于DEME液體培養(yǎng)液，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度至1×105/mL。

植入物的準(zhǔn)備 ①導(dǎo)管準(zhǔn)備:輸液器針頭套管，內(nèi)徑2.2 mm，剪成長(zhǎng)度為1 cm的片段。分別經(jīng)碘伏、75%酒精浸泡24 h，經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)無(wú)菌。②內(nèi)置薄膜:取自電纜內(nèi)側(cè)緣，擦洗干凈，裁剪成1 cm×0.5 cm大小，分別經(jīng)碘伏、75%酒精浸泡24 h，經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)無(wú)菌。③植入物準(zhǔn)備:在超凈臺(tái)內(nèi)，將薄膜輕柔卷曲，置入導(dǎo)管內(nèi)。在植入大鼠體內(nèi)前1 d，置于胎牛血清中37℃孵育過(guò)夜。再將血清中的特制導(dǎo)管取出，用無(wú)菌PBS液漂洗2遍。放入提前制備好的菌懸液中，37℃孵育4 h。

動(dòng)物模型的構(gòu)建 ①動(dòng)物準(zhǔn)備:實(shí)驗(yàn)前3 d開(kāi)始免疫抑制，按50 mg/kg的劑量腹腔注射，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。②導(dǎo)管置入:大鼠背部切口1～1.2 cm，剝離皮下組織，游離皮膚，形成2 cm以上的腔管。放入提前制備好的導(dǎo)管，每只大鼠體內(nèi)放入3個(gè)，縫合皮膚。③創(chuàng)口維護(hù):每天2次觀察傷口感染情況，用無(wú)菌生理鹽水清洗創(chuàng)口，并用碘伏消毒。④移除導(dǎo)管:分別在植入后24 h、48 h、72 h，在無(wú)菌條件下將導(dǎo)管取出，取出導(dǎo)管內(nèi)薄膜，倒置顯微鏡下觀察生物膜形成情況。

形態(tài)觀察 將取出的導(dǎo)管經(jīng)PBS洗滌3次后，置于10%多聚甲醛液中室溫固定過(guò)夜，經(jīng)脫水等處理后分別進(jìn)行直接普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

活性檢測(cè) 將生物膜自大鼠體內(nèi)取出后，經(jīng)PBS洗滌3次后放置于24孔板中，加入2 mL DMEM液體培養(yǎng)基，加入 MTT 200 μL，37℃孵育4 h后取出，棄除培養(yǎng)液，加入150 μL DMS0，置于搖床上勻速混勻10 min后棄除DMSO，置于酶標(biāo)儀中，在490 nm處檢測(cè)吸收值。各孔OD值與調(diào)零孔平均值之差代表各孔生物膜的代謝活性。

統(tǒng)計(jì)分析所獲得的數(shù)據(jù)均用(±s)表示，采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組間數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD-T檢驗(yàn);實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)觀察

直接鏡檢和掃描電鏡結(jié)果均顯示生物膜經(jīng)歷黏附、聚集、微菌落形成及外分泌基質(zhì)的釋放和包裹過(guò)程，最終形成了拉絲狀的基質(zhì)將菌體包裹住的團(tuán)塊 (見(jiàn)圖1)。

2.2 體內(nèi)新生隱球菌生物膜活性

MTT法檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示采用大鼠構(gòu)建新生隱球菌體內(nèi)生物膜模型時(shí)需對(duì)大鼠進(jìn)行免疫抑制;同時(shí)，新生隱球菌體內(nèi)生物膜活性檢測(cè)顯示隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，體內(nèi)生物膜活性逐漸增強(qiáng)(見(jiàn)圖2)。

3 討 論

隨著置管術(shù)等創(chuàng)傷性診療技術(shù)的廣泛應(yīng)用及開(kāi)展，HIV/AIDS的患病率和發(fā)病率的不斷上升，腫瘤等惡性疾病的增多，以及器官移植術(shù)的全面推廣以及免疫抑制藥物的大量應(yīng)用，病原真菌尤其是侵襲性病原真菌導(dǎo)致的患病率與發(fā)病率呈不斷上升的態(tài)勢(shì)，使得臨床工作面臨巨大的挑戰(zhàn)［5］。作為一種重要的臨床致病真菌，新生隱球菌在侵襲性真菌感染中有著重要的地位。其主要引起免疫力低下人群或部分免疫正常人群的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，導(dǎo)致致命的新生球菌性腦膜炎，在缺乏及時(shí)正確的抗真菌治療的情況下，致死率可高達(dá)90%以上［6］。抗真菌藥物的缺乏以及真菌耐藥的產(chǎn)生，使得臨床抗真菌治療工作更加困難。真菌耐藥常由以下幾個(gè)原因:菌種突變，新型致病真菌的產(chǎn)生以及生物膜形成。其中，真菌生物膜形成是導(dǎo)致臨床上真菌耐藥性的主要機(jī)制之一。1986年Waltham自1例冠脈搭橋術(shù)患者的導(dǎo)管中觀察到形成生物膜的新生隱球菌，證實(shí)新生隱球菌形成生物膜的可能［7］。

圖1 新生隱球菌體內(nèi)生物膜形態(tài)觀察結(jié)果 (a.×200，b.×200，c.×200，d.×500，e.×200，f.×500);a-c.直接鏡檢結(jié)果，d-f.掃描電鏡結(jié)果;a，d.新生隱球菌少量附著于導(dǎo)管內(nèi)壁;b，e.附著于內(nèi)壁的菌體不斷聚集，形成微菌落;c，f.菌體分泌外基質(zhì)，將菌體包裹 圖2 不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)新生隱球菌生物膜活性(*.P＜0.05)Fig.1 Images of C.neoformans biofilm morphology in vivo(a.×200，b.×200，c.×200，d.×500，e.×200，f.×500);a-c.The direct light microscopy images of the C.neoformans biofilm in vivo;d-f.The SEM images of the C.neoformans biofilm in vivo;a，d.Several C.neoformans cells adhesion to the inner side of the catheter;b，e.The yeast cells adhered to the inner side of the catheter contious assembling and developing microcolony;c，f.Cells in the biofilm was wrapped up by the extracellular matrix(ECM)secreted by the yeasts Fig.2 C.neoformans biofilm vitability at different time points(*.P ＜0.05)

生物膜的形成是一個(gè)多步生長(zhǎng)行為，涉及復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物過(guò)程［8］。生物膜主要在外源性有機(jī)移植物表面形成，例如:假牙組織、導(dǎo)管等有機(jī)材料［9］。因此體外多以PVC等有機(jī)材料為支持物構(gòu)建體外生物膜模型。但是由于體外模型不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，構(gòu)建體內(nèi)模型就顯得尤為重要。

2004年，D Andes等［10］成功構(gòu)建大鼠中心靜脈管皮下置管白念珠菌生物膜體內(nèi)模型，為研究生物膜體內(nèi)耐藥等提供有效平臺(tái)。徐瑞宏等［11］所建立的新生隱球菌新西蘭兔中心靜脈置管生物膜模型同樣建立了有效的隱球菌生物膜體內(nèi)感染模型研究模型。但該模型在構(gòu)建過(guò)程中需要采用中心靜脈置管術(shù)，對(duì)于術(shù)者的操作能力要求較高，不便于開(kāi)展樣本量較大的實(shí)驗(yàn)研究。本文所建立的大鼠模型，操作方便，可獨(dú)立進(jìn)行并完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，通過(guò)MTT法進(jìn)行體內(nèi)生物膜活性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)定量的方法對(duì)生物膜的活性進(jìn)行鑒定，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［12］。本工作將為后續(xù)研究新生隱球菌的毒性因子及耐藥機(jī)理提供提有效的基礎(chǔ)。

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