高 陽， 朱春暉， 譚新球，劉 勇， 彭 靜， 張德詠＊

（

1.湖南省植物保護研究所，長沙 410125；2.園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室，長沙 410125；3.中南大學(xué)研究生院隆平分院，長沙 410125）

隨著許多重要農(nóng)業(yè)昆蟲如蚜蟲等小型昆蟲全基因組的測定，昆蟲基因改造和轉(zhuǎn)錄組研究的日趨深入，RNA的提取越來越成為昆蟲分子生物學(xué)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而許多重要農(nóng)業(yè)昆蟲如煙蚜、煙粉虱和西花薊馬個體較小，蛋白質(zhì)含量高，RNA含量少，提取困難。目前常用的昆蟲RNA提取方法有試劑盒法、CTAB 法、Trizol法、SDS－KAC－熱酚法［1］、改進(jìn)的一步法［2］等，但這些方法都有一定缺陷，如費用高、操作步驟多、提取耗時長等。

對于小型昆蟲來說，能否有效地去除蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)、盡可能減少RNA損失是提取高質(zhì)量RNA成敗的關(guān)鍵。硅粒吸附法是一種有效的RNA提取方法，由于其操作簡便、安全性高并且穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于植物組織和病毒的總RNA提?。?－4］。本文對該方法進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)后，應(yīng)用于煙蚜、煙粉虱和西花薊馬總RNA的提取?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗使用的材料為煙蚜［Myzus persicae（Sulzer）］、煙粉虱 Q 隱種［Bemisia tabaci（Gennadius）Q sibling species］和西花薊馬［Frankliniella occidentalis（Pergande）］的活體成蟲，采集于湖南省農(nóng)科院植物保護研究所溫室內(nèi)。

1.2 試劑

異硫氰酸胍購自BIO BASIV INC，聚乙烯吡咯烷酮P－40（PVP－40）和二氧化硅（SiO2）購自Sigma公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，水飽和酚（pH＜5.2）購自BoMei公司，其他均為國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。研磨緩沖液（GB）、洗滌緩沖液（WB）、10%月桂酰肌氨酸鈉溶液（NLS）、NaI溶液和硅粒懸浮溶液均按照文獻(xiàn)方法［2］制備。

1.3 RNA提取方法

1.3.1 改良的硅粒吸附法

參照張德詠等［3］方法并改進(jìn)。取煙蚜蟲體20頭（煙粉虱Q隱種和西花薊馬100頭），用ddH2O漂洗，吸水紙吸干后放入1.5mL滅菌離心管中，加入500μL GB和100μL NLS（10%）溶液，用高壓滅菌的一次性研磨棒進(jìn)行研磨。隨后70℃溫浴10min，不時搖動。冰上放置5min后離心10min（13000r／min）。取500μL上清液，加入等體積水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），搖動混勻后，室溫下離心5min（12000r／min）。取上清液，加入150μL無水乙醇，300μL NaI，25μL硅粒懸浮溶液，室溫下不停搖動10min。離心1min（6000r／min），倒掉上清液。加500μL WB洗滌2～3次（充分懸浮至上清液中無漂浮的硅顆粒為止），每次6000r／min離心1min。沉淀加ddH2O 75μL，70℃溫浴4min后離心3min（13000r／min），取上清50μL，－20℃保存。

1.3.2 Trizol法

取煙蚜蟲體20頭（煙粉虱Q隱種和西花薊馬100頭）放入1.5mL滅菌離心管中，在液氮保護下用高壓滅菌的一次性研磨棒進(jìn)行研磨。加入1mL Trizol試劑進(jìn)行裂解，在室溫下放置5min后加入0.2mL氯仿，充分混勻，在室溫下放置2min，離心15min（4℃，12000g）；取上層水相，加0.5mL異丙醇，在室溫下放置10min，離心10min（4℃，12000g）；棄上清，加1mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌離心5min（4℃，7500g），棄上清；沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用50μL DEPC水溶解RNA沉淀，－70℃保存。

1.3.3 改進(jìn)的一步法

取煙蚜蟲體20頭（煙粉虱Q隱種和西花薊馬100頭），參照景天忠等［2］的方法進(jìn)行，最后用50μL DEPC水溶解RNA沉淀，－70℃保存。

1.4 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

從總RNA提取物中取5μL，與2μL 6×loading buffer和3μL SYBR GreenⅠ熒光染料混合后，在2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳20min（電壓140V）。用FluorChem FC2凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech，USA）拍照檢測。

1.5 總RNA紫外分光光度計檢測

分別取煙蚜RNA提取物10μL，煙粉虱Q隱種和西花薊馬RNA提取物各20μL，加ddH2O稀釋到500μL，用TU－1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析）測定其在230、260和280nm的吸光度，對RNA的純度進(jìn)行評估。

1.6 RT－PCR反應(yīng)檢測RNA的質(zhì)量

取1μL煙蚜、煙粉虱Q隱種和西花薊馬的RNA，用兩步法做 RT－PCR，根據(jù)已有文獻(xiàn)［5－7］設(shè)計3對引物（由華大基因合成），如表1所示。其中煙蚜、煙粉虱Q隱種和西花薊馬擴增目標(biāo)條帶的長度分別為900、230和180bp。

表1 三種小型昆蟲RT－PCR引物Table 1 All primers used for RT－PCR

RT－PCR反應(yīng)條件：

第一鏈的合成：取昆蟲總RNA 9μL，加1μL 3′端引物（20μmol／L）；保溫5min；取出后迅速放到冰上，加入配好的反轉(zhuǎn)錄體系混合液，（2000U反轉(zhuǎn)錄酶1μL，2mmol／L dNTPs 2μL，5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5μL，滅菌ddH2O 17μL）；使用 PCR 儀于42℃反應(yīng)50min。

第二鏈的合成：以第一鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：10×反應(yīng)緩沖液2.0μLdNTP混合物（10mmol／L）0.4μL，5′端 引 物 （10μmol／L）1.0μL，3′端引物（10μmol／L）1.0μL，模板1.0μL，Taq DNA聚合酶，5U／μL 0.4μL，加滅菌ddH2O至終體積為20μL。

PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s；55～56℃退火50s；72℃延伸1min；步驟2～4循環(huán)30次；72℃延伸10min，4℃保存。

1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，用FluorChem FC2（Alpha Innotech，USA）凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測擴增結(jié)果，煙蚜RPS2擴增產(chǎn)物送華大基因測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的質(zhì)量比較

用改進(jìn)的一步法、改良的硅粒吸附法和Trizol法等3種方法提取3種小型昆蟲總RNA（圖1），結(jié)果表明3種方法中改良的硅粒吸附法提取的RNA損失最小，條帶最清晰，完整性較好。而且改良硅粒吸附法提取的3種昆蟲總RNA電泳條帶清晰無彌散，28SrRNA和18SrRNA的亮度接近2∶1，說明改良硅粒吸附法提取的RNA無降解，質(zhì)量較好，可用于小型昆蟲的總RNA提取。

圖1 三種方法提取三種昆蟲的總RNA（5μL）Fig.1 The RNAs of three insects extracted by three methods

2.2 RNA濃度、純度及產(chǎn)率檢測

通過紫外分光光度計檢測3種方法提取的3種昆蟲總RNA，結(jié)果如表2所示。由表2可見，改良的硅粒吸附法所得的3種昆蟲總RNA A260／A280值都在1.8以上，蛋白質(zhì)污染相對較少。另外A260／A230值都接近2.0，說明其他污染也較少。

表2 三種昆蟲的RNA純度及濃度Table 1 The purity and concentration of RNA extracted from three insects

與常規(guī)的改進(jìn)的一步法和Trizol法等方法相比，改良的硅粒吸附法提取的3種昆蟲總RNA產(chǎn)率略高，說明該方法是一種較好的提取昆蟲總RNA的方法。

2.3 PCR檢測

用改良的硅粒吸附法提取的3種昆蟲總RNA作為模板同時進(jìn)行兩步法RT－PCR反應(yīng)和普通PCR反應(yīng)，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（見圖2）表明：3種昆蟲的RT－PCR產(chǎn)物條帶單一，且與預(yù)期的大小一致。試驗中以RNA為模板進(jìn)行PCR以及CK對照均無目標(biāo)條帶。其中煙蚜RT－PCR產(chǎn)物測序后進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，本研究擴增得到的片段與文獻(xiàn)中煙蚜RPS2基因序列（登錄號：XM＿001945112）同源性為96.46%。該結(jié)果說明：此方法提取的總RNA可以用于RT－PCR。

圖2 電泳檢測結(jié)果

3 討論

硅粒吸附法是一種快速、高效和經(jīng)濟的植物總RNA提取方法［4］，本文對其進(jìn)行改良后應(yīng)用于小型昆蟲總RNA提取。由于煙粉虱等小型昆蟲個體小，RNA含量少，蛋白質(zhì)含量高，本試驗對材料的研磨破碎過程進(jìn)行了簡化，同時增加了水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）對蛋白質(zhì)的抽提。試驗結(jié)果顯示，不使用水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）對蛋白質(zhì)進(jìn)行抽提，基本得不到RNA產(chǎn)物，原因是昆蟲蛋白質(zhì)的存在會黏附硅顆粒，使其失去作用而導(dǎo)致試驗失敗。

試驗發(fā)現(xiàn)，使用改良的硅粒吸附法提取的小型昆蟲RNA穩(wěn)定性好，試驗所用到的試劑用滅菌ddH2O配制即可。采用本方法提取的RNA穩(wěn)定的原因可能是硅粒對RNA的特定吸附作用，同時配合RNA酶的強抑制劑，使提取的RNA中的RNA酶去除得非常干凈。此外，試劑中的聚乙烯吡咯烷酮P－40（PVP－40）最好不要用PVP系列的其他產(chǎn)品代替，否則提取的RNA純度會受到影響（結(jié)果未顯示）。

與傳統(tǒng)的Trizol法和改進(jìn)的一步法相比，改良的硅粒吸附法是一種經(jīng)濟高效的小型昆蟲總RNA提取方法，RNA產(chǎn)率高，純度佳。同時由于減少了揮發(fā)性有毒試劑DEPC的使用，本方法對實驗人員的毒害性大大降低。

綜上所述，改良的硅粒吸附法提取的小型昆蟲總RNA質(zhì)量好，完整性高，能夠滿足RT－PCR試驗的要求。另外，整個試驗操作簡單、省時，所用試劑普遍、廉價，是提取小型昆蟲總RNA的理想方法。

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