張長虹 吳 濤* 周 俊 姜瑞民

冰凍稀有血型紅細(xì)胞可及時(shí)解決稀有血型患者的急診輸血[1-4]。由于冰凍紅細(xì)胞具有保存期長、可大量貯存及解凍去甘油后質(zhì)量可靠等優(yōu)點(diǎn)，因而對公共突發(fā)事件及軍隊(duì)?wèi)?zhàn)時(shí)緊急大量用血具有重要意義[5-6]。

目前，機(jī)器制備冰凍紅細(xì)胞主要采用進(jìn)口115型和215型血流處理儀。215型血流處理儀是一種全自動(dòng)多功能的密閉系統(tǒng)，擁有振蕩混合平臺(tái)及連續(xù)流動(dòng)洗滌系統(tǒng)，可用于紅細(xì)胞的甘油化及去甘油化[7-8]。去甘油洗滌僅需30～40 min(人工操作則需數(shù)小時(shí))。215型血流處理儀實(shí)現(xiàn)了全封閉洗滌，管路與血袋連接通過無菌接駁機(jī)接駁完成，甘油化管路串聯(lián)了無菌濾器，對環(huán)境要求較低，減少消毒劑對工作場地污染，操作簡便，制備產(chǎn)品細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)陰性，為以后去甘油化冰凍紅細(xì)胞終產(chǎn)品添加保存劑、仿照普通紅細(xì)胞4℃較長期保存的研究奠定了基礎(chǔ)[9]。其缺點(diǎn)為該設(shè)備需技術(shù)熟練人員進(jìn)行操作，成本較高，機(jī)器價(jià)格及耗材昂貴難以推廣[10]。因此，本研究對全自動(dòng)血細(xì)胞處理儀進(jìn)行研制和臨床驗(yàn)證。

1 全自動(dòng)血細(xì)胞處理儀的原理與設(shè)計(jì)思路

1.1 制備冰凍紅細(xì)胞原理

長期保存紅細(xì)胞則需要降低紅細(xì)胞的代謝速度，其取決于保存溫度。如果將血液保存在很低的溫度下可降低或完全停止紅細(xì)胞的代謝活動(dòng)，從而避免代謝毒性產(chǎn)物的積累，達(dá)到紅細(xì)胞延長保存期的目的[11]。血液在0 ℃以下時(shí)紅細(xì)胞周圍會(huì)形成冰晶，易刺破紅細(xì)胞膜或損傷紅細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)而引起溶血。保持紅細(xì)胞在低溫下長期保存而不受破壞的關(guān)鍵是冰凍保存紅細(xì)胞，常用的方法是添加保護(hù)液防止紅細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，而甘油則是最常用的保護(hù)液。在制備冰凍紅細(xì)胞過程中加入甘油保護(hù)劑是關(guān)鍵一步[12-14]。

1.2 解凍洗滌紅細(xì)胞原理

由于甘油的滲透壓較高，進(jìn)入人體內(nèi)會(huì)造成細(xì)胞溶血。因此，在使用解凍紅細(xì)胞前必須對其進(jìn)行清洗去除。目前通用的方法是在解凍后的紅細(xì)胞中分階段加入不同濃度的鹽水，利用細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的不同來置換出細(xì)胞內(nèi)部甘油，在置換過程中細(xì)胞內(nèi)的甘油濃度越來越低，而水分子含量越來越高，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差逐漸變小呈現(xiàn)降滲過程，直至細(xì)胞內(nèi)外呈等滲狀態(tài)后置換過程停止，清洗過程結(jié)束。目前實(shí)用的洗滌方法均屬于降滲洗滌方式[15-16]。

血細(xì)胞處理儀的基本工作流程為：紅細(xì)胞甘油化→凍融紅細(xì)胞去甘油化→洗滌紅細(xì)胞(如圖1、圖2、圖3所示)。

2 設(shè)備基本結(jié)構(gòu)及各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)的檢測

設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。

圖1 紅細(xì)胞甘油化工藝流程

圖2 凍融紅細(xì)胞去甘油化工藝流程

圖3 洗滌紅細(xì)胞工藝流程

圖4 設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖

(1)操作面板。以中文、彩色圖形方式顯示工作全過程信息、各技術(shù)參數(shù)實(shí)時(shí)值、報(bào)警信息及故障處理提示，并提示操作步驟，使操作者能夠直接控制血細(xì)胞處理儀的相關(guān)工作。

(2)清洗泵。清洗泵輸送各種濃度清洗液至液體袋或離心杯的蠕動(dòng)泵。

(3)轉(zhuǎn)移泵。轉(zhuǎn)移泵輸送各種濃度清洗液至液體袋或?qū)⒀恨D(zhuǎn)移至離心杯及成品袋的蠕動(dòng)泵。

(4)離心機(jī)。離心機(jī)工作時(shí)以5200 r/min的速度帶動(dòng)離心杯高速旋轉(zhuǎn)。當(dāng)輸入含多種成份細(xì)胞液體時(shí)，根據(jù)各種細(xì)胞密度的不同，進(jìn)行細(xì)胞成份分離。當(dāng)離心杯發(fā)生破裂、漏液時(shí)，離心機(jī)內(nèi)漏液感應(yīng)器立即報(bào)警，停止離心機(jī)和泵的運(yùn)行。

(5)管路空氣探測器。在處理過程中，如探測出空管時(shí)血細(xì)胞處理儀將報(bào)警，以提示操作者的注意。

(6)管路壓力監(jiān)測器。用于實(shí)時(shí)監(jiān)視管道內(nèi)介質(zhì)壓力，當(dāng)超出規(guī)定范圍時(shí)會(huì)自動(dòng)發(fā)出報(bào)警信息。

(7)閥門。血細(xì)胞處理儀閥門按照程序的命令開與閉，控制相應(yīng)管路的開啟和關(guān)閉。

(8)電子秤。提供可選擇的成品重量作為補(bǔ)充功能。

2 儀器各項(xiàng)最佳性能參數(shù)的確定

(1)離心機(jī)轉(zhuǎn)速：其工作轉(zhuǎn)速為3000～5200 r/min，誤差＜±10%。

(2)轉(zhuǎn)移泵轉(zhuǎn)速：4～200 r/min，誤差＜±2 r/min。

(3)清洗泵轉(zhuǎn)速：4～200 r/min，誤差＜±2 r/min。

(4)噪聲：其運(yùn)行噪聲為75～100 dB。

(5)振動(dòng)幅度：工作中振動(dòng)幅度為0.2～0.5 mm。

(6)搖擺組件：搖擺組件承載重量為1000～4000 g時(shí)可正常運(yùn)行。

(7)搖擺速度：12～20 r/min，誤差＜±2 r/min。

3 處理后紅細(xì)胞的臨床驗(yàn)證

對處理后的紅細(xì)胞進(jìn)行臨床驗(yàn)證，是指其受試品的選擇、分組、檢測指標(biāo)與方法、統(tǒng)計(jì)方法以及在不同工作條件下血細(xì)胞處理儀對紅細(xì)胞處理后的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測。選擇在環(huán)境溫度為-10～+60 ℃、相對濕度為10%～90%的條件下進(jìn)行檢測。

3.1 受試品的選擇

選擇在采血中心正常捐獻(xiàn)的血液60袋(2 U/袋)，并按照試驗(yàn)需求進(jìn)行成分分離制備和保存。

3.2 分組

本試驗(yàn)采用隨機(jī)、對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。由計(jì)算公式1計(jì)算樣本量，其中N為每組的例數(shù)。

3.3 檢測指標(biāo)與方法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)“GB 18469-2012全血與成分血質(zhì)量要求”的檢測指標(biāo)進(jìn)行檢測。冰凍紅細(xì)胞解凍洗滌之后肉眼觀察其外觀、容量，并立即留樣檢測血紅蛋白含量，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和無菌試驗(yàn)；并在第一時(shí)間對樣本進(jìn)行離心，分離上清檢測游離血紅蛋白及甘油殘留量。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測血紅蛋白含量，采用三波長法檢測游離血紅蛋白；使用Nageotte計(jì)數(shù)板檢測殘余白細(xì)胞數(shù)；采用滲透壓法測定甘油的殘余量(Digital Spectrometer儀器測定)；采用常規(guī)無菌試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌檢測。其中用血清比重反映甘油殘留量，當(dāng)甘油含量為1%(10 g/L)時(shí)，其克分子濃度為420 mmol/L，其滲透壓為420 m O sm/L，對應(yīng)的血清比重為1.0115。

采用與分離上清檢測游離血紅蛋白及甘油殘留量相同的方法分離上清檢測蛋白質(zhì)含量和游離血紅蛋白，計(jì)算溶血率。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測血紅蛋白含量，采用腦脊液蛋白測定法檢測洗滌紅細(xì)胞上清蛋白含量，采用雙波長法檢測游離血紅蛋白，采用常規(guī)無菌試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌檢測。

4 制定血細(xì)胞處理儀注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

為了確保血細(xì)胞處理儀的產(chǎn)品質(zhì)量和使用安全，使血細(xì)胞處理儀的生產(chǎn)有章可循，檢驗(yàn)有據(jù)可依，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)的規(guī)定，制定注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)“GB 9706.1-2007醫(yī)用電氣設(shè)備 第一部分：安全通用要求”進(jìn)行編寫，編寫格式按按照國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫”和“醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理辦法”的要求進(jìn)行編寫。

5 結(jié)論

全自動(dòng)血細(xì)胞處理儀的研制，可實(shí)現(xiàn)冰凍紅細(xì)胞的全自動(dòng)制備，其程序化可最大程度減少人為差錯(cuò)和事故的發(fā)生，保證產(chǎn)品質(zhì)量。自動(dòng)化操作減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，可做到一人多機(jī)操作，克服了手工洗滌操作步驟多、所需時(shí)間長、工作效率低及人為因素影響大等諸多問題。在全自動(dòng)細(xì)胞處理儀封閉的系統(tǒng)中，通過蠕動(dòng)泵控制甘油加入速度。在加入甘油的過程中采用配套的搖擺機(jī)，用于懸浮紅細(xì)胞與甘油的混勻。搖擺機(jī)采用360o搖擺方式為創(chuàng)新之處，與往復(fù)式和翹板式搖擺機(jī)相比其混合效果更佳，同時(shí)搖擺速度可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。與國外同類其他設(shè)備耗材相比，研制的全自動(dòng)血細(xì)胞處理儀設(shè)備及耗材可實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，價(jià)格相對較低，便于國內(nèi)不同級別的地方血站，尤其是軍隊(duì)血站在建立戰(zhàn)備稀有血型庫中推廣使用。

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