賀 偉 劉玉俠(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 30003)

免疫治療已成為惡性腫瘤繼手術(shù)、化療、放療后第四大治療方式。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞因體外增殖速度快、抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣、可以調(diào)節(jié)并增強機體的免疫功能等優(yōu)勢逐漸成為研究的熱點〔1〕。本實驗通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞對人食道鱗癌細(xì)胞(ESCC)Ecap-109的體外殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 IMDM培養(yǎng)基，GIBCO公司;IFN-γ，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司;IL-1α，Peprotech公司;CD3Ab，RD公司;IL-2，北京四環(huán)生物制藥有限公司;FCS，天津TBD公司;MTT購自 Sigma;抗人 CD3-FITC，抗人 CD16、CD56-PE，BD 公司。ESCC Ecap-109購于上海生物細(xì)胞研究所。超凈工作臺，上海金帆空氣凈化工程公司;低溫高速離心機，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國科峻公司;全自動酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司。

1.2 外周血單核細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單核細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng) 將分離培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞加入 IFN-γ 1 000 U/ml，CD3Ab 100 ng/ml，IL-1α 1 000 U/ml，IL-2 1 000 U/ml，3 d后換液，同時補加IL-2。

1.4 CIK細(xì)胞表型的測定 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞用FITC標(biāo)記的CD3Ab、PE標(biāo)記的CD16、CD56Ab標(biāo)記CIK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定CD3+CD16+CD56+細(xì)胞的表達。

1.5 Ecap-109細(xì)胞的培養(yǎng) 將Ecap-109用含10%IMDM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化后離心洗滌，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5×104/ml，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.6 CIK細(xì)胞對Ecap-109殺傷活性測定 將培養(yǎng)的CIK細(xì)胞調(diào)細(xì)胞數(shù)為2.5×106/ml和1.25×106/ml，按以下設(shè)計加入到已接種Ecap-109的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)6復(fù)孔。Ecap-109對照組、CIK1對照組(2.5×106/ml);CIK2對照組(1.25×106/ml);CIK1+Ecap-109組(50∶1);CIK2+Ecap-109組(25∶1);培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT，用酶標(biāo)儀在292 nm處 測 OD 值。 殺 傷 活 性 =

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞表型測定結(jié)果 CD3+CD16+CD56+表達為74.3%。見圖1。

圖1 CIK表型測定結(jié)果

2.2 CIK細(xì)胞對Ecap-109細(xì)胞殺傷活性 隨著CIK細(xì)胞數(shù)量的增加，對腫瘤細(xì)胞的殺傷力更強(50∶1＞25∶1，P＜0.05)。見表1。

表1 CIK細(xì)胞對Ecap-109細(xì)胞殺傷活性(n=6，±s)

表1 CIK細(xì)胞對Ecap-109細(xì)胞殺傷活性(n=6，±s)

與CIK2+Ecap-109組比較:1)P＜0.05

組別 OD值 殺傷率(%)0.694±0.024 －CIK1組 1.495±0.039 －CIK2組 1.031±0.020 －CIK1+Ecap-109組 1.532±0.0931) 94.81±3.901)CIK2+Ecap-109組Ecap-109組1.180±0.059 78.26±8.57

3 討論

目前研究較多的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞主要包括淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞〔2〕、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)〔3〕、抗CD3抗體激活的殺傷細(xì)胞(CD3AK)〔4〕、CIK等，但 LAK細(xì)胞、TIL等的抗腫瘤活性較低，限制了其在臨床的應(yīng)用〔5〕。

CIK細(xì)胞是將人外周血單核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。由于該種細(xì)胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。應(yīng)用CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。

CIK細(xì)胞同時表達多種細(xì)胞因子受體，且多項體內(nèi)模型顯示，CIK細(xì)胞經(jīng)靜脈回輸體內(nèi)后可以遷移至腫瘤部位。在腫瘤局部，CIK細(xì)胞可以發(fā)揮細(xì)胞毒作用，控制腫瘤的生長。與其他抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞相比CIK細(xì)胞具有體外增殖速度快、抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣、毒性作用小等優(yōu)點〔1，6〕。此外，CIK 細(xì)胞還可以調(diào)節(jié)并增強機體的免疫功能〔7〕。因此，CIK細(xì)胞過繼性免疫治療逐漸成為實體腫瘤或血液系統(tǒng)腫瘤治療的新選擇，逐漸成為研究的熱點。本實驗表明CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的強大殺傷力。表明在臨床應(yīng)用時CIK細(xì)胞要達到一定的細(xì)胞數(shù)量，以保證治療效果。

1 Hontscha，Borck Y，Zhou H，et al.Clinical trials on CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC)〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011;137(2):305-10.

2 Rosenberg S.Lymphokine-activated killer cells:a new approach to immunotherapy of cacer〔J〕.J Natl Cancer Inst，1985;75(4):595-603.

3 Rosenberg SA，Spiess P，Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes〔J〕.Science，1986;233(4770):1318-21.

4 Yun YS，Hargrove ME，Ting CC.In vivo antitumor activity of anti-CD3 induced activated killer cells〔J〕.Cancer Res，1989;49(17):4770-4.

5 Shablak A，Hawkins RE，Rothwell DG，et al.T cell-based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma:modest success and future perspective〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(21):6503-10.

6 Sehmidt-Wolf IG，Negrin RS，Kiem HP，et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity〔J〕.J Exp Med，1991;174(1):139-49.

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