羅玉玉 趙 瑛 孔麟麟 張文成

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，天津 300162)

人ZNF580基因是本課題組以致動(dòng)脈粥樣硬化因素-低密度脂蛋白誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，采用差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)分析得到的一個(gè)新基因(Genbank注冊(cè)號(hào):AF184939)。其cDNA編碼的蛋白屬于C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員〔1，2〕。前期研究顯示:ZNF580在人體多種組織均有表達(dá)，可能是一種多信號(hào)響應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種途徑的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程〔3〕。為了深入研究ZNF580可能參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，課題組應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選了人胎腦cDNA文庫(kù)，獲得了可能與ZNF580存在相互作用的14種蛋白〔4〕。但由于酵母屬于低等的真核生物，發(fā)生于其體內(nèi)的蛋白間的相互作用，并不一定確實(shí)存在于高等的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，因此我們還需要進(jìn)一步在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)加以驗(yàn)證。本研究擬構(gòu)建并擴(kuò)增帶有免疫標(biāo)簽的ZNF580真核表達(dá)載體，并應(yīng)用于后續(xù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞系 pCDEF Flag Vector購(gòu)自上海睿星基因公司;pGB-ZNF580本室保存;E.coli DH5α感受態(tài)本室保存;HEK293細(xì)胞系本室保存。

1.2 主要試劑和試劑盒 T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SfiI購(gòu)自Promega公司;細(xì)胞培養(yǎng)試劑、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備 Forma3111 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)forma公司);Scotsman AF 100制冰機(jī)(美國(guó)Bio-Rad公司);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);CK-40倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);超低溫冰箱(日本Sanyo公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)GelPro);超純水系統(tǒng)(美國(guó)Minipore公司)。

1.4 酶切反應(yīng) 將pGB-ZNF580及pCDEF-Flag質(zhì)粒進(jìn)行SfiI酶切。反應(yīng)體系:SfiⅠ限制性內(nèi)切酶0.5 μl;10倍緩沖液2 μl;100 × BSA 0.2 μl;質(zhì)粒 17.3 μl，50℃，2 h。

1.5 純化回收目的片段及連接反應(yīng) 瓊脂糖電泳后，切膠回收目的片段。具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將回收的ZNF580片段亞克隆到pCDEF-Flag載體中，構(gòu)建重組載體pCDEF-Flag-ZNF580。反應(yīng)體系:T4 DNA連接酶1 μl;10×T4緩沖液1 μl;純化的線狀載體2.5 μl(100 ng);回收的ZNF580片段 5.5 μl(200 ng);共 10 μl混勻，16℃，連接過(guò)夜。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài) 10 μl連接液全部加至含100 μl感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，鋪板前，3 000 r/min離心5 min，棄掉約150 μl上清，剩余液體重懸沉淀，全部鋪于LB平板上，培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)4～8 h。

1.7 重組質(zhì)粒提取及鑒定 按試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，部分菌液送Takara公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 pGB-ZNF580酶切 pGB-ZNF580酶切結(jié)果見圖1，在500 bp處可見ZNF580目的條帶。

圖1 pGB-ZNF580酶切

2.2 pCDEF-Flag質(zhì)粒酶切 pCDEF-Flag質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖2，兩條條帶分別為酶切前和酶切后。

圖2 pCDEF-Flag質(zhì)粒酶切

2.3 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒酶切 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖3，在500 bp處可見ZNF580目的條帶。

圖3 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒酶切

2.4 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒測(cè)序 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒部分測(cè)序結(jié)果見圖4，經(jīng)分子生物學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，重組質(zhì)粒序列完全正確。

圖4 pCDEF-Flag-ZNF580重組質(zhì)粒測(cè)序

3 討論

ZNF580是由本課題組首先克隆的一種可能與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的鋅指基因。其編碼的蛋白屬于一種新的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子〔1～3〕。研究顯示:C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制的重要參與者，其轉(zhuǎn)錄活性改變可影響其下游多種靶基因的表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞生命活動(dòng)及疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔5，6〕。傳統(tǒng)認(rèn)為，鋅指結(jié)構(gòu)的主要功能是作為DNA結(jié)合域，與靶基因富含G/C的順式作用元件結(jié)合，識(shí)別靶基因調(diào)控區(qū)9個(gè)核苷酸組成的順式作用元件。但越來(lái)越多的證據(jù)顯示:鋅指結(jié)構(gòu)既可結(jié)合DNA，又可結(jié)合蛋白質(zhì)。且在結(jié)合蛋白質(zhì)方面，鋅指結(jié)構(gòu)具有更加重要而廣泛的作用〔7〕。課題組前期為了尋找可能與轉(zhuǎn)錄因子ZNF580存在相互作用的蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選了人胎腦cDNA文庫(kù)，獲得了可能與ZNF580存在相互作用的14種蛋白〔4〕。這些蛋白中有一些是與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程有關(guān)的蛋白，還有一些是和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)或者和某些酶蛋白活性有關(guān)的蛋白分子，這與ZNF580本身作為轉(zhuǎn)錄因子的性質(zhì)相吻合。

但到目前為止，還沒有直接的證據(jù)證明ZNF580與它們之間的相互作用。酵母雙雜交的結(jié)果僅僅是初步提出一個(gè)相互作用可能性，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子之間的相互作用是十分復(fù)雜的，時(shí)空特異性等方面的偏差會(huì)導(dǎo)致一些假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。另外，酵母細(xì)胞是最簡(jiǎn)單的真核細(xì)胞，其體內(nèi)蛋白質(zhì)合成后加工修飾類型及其程度與哺乳動(dòng)物的相應(yīng)過(guò)程存在明顯差別。因此，由酵母篩選出來(lái)的結(jié)果還必須在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)一步嚴(yán)格驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建并擴(kuò)增的帶有免疫標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCDEF-Flag-ZNF580正是為后續(xù)進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的免疫共沉淀等驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)。此重組表達(dá)載體構(gòu)建的成功也為進(jìn)一步研究ZNF580可能參與的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終揭示其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 張文成.血管內(nèi)皮細(xì)胞中低密度脂蛋白及高密度脂蛋白反應(yīng)性基因的克隆、鑒定與組織分布〔D〕.博士后出站工作報(bào)告.北京，2001.

2 張文成，陳保生，曾武威，等.低密度脂蛋白降調(diào)節(jié)新基因cDNA的克隆及結(jié)構(gòu)分析〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001;81(7):435-6.

3 張文成，陳保生，吳 剛，等.低密度脂蛋白誘導(dǎo)下調(diào)的新基因cDNA的克隆及組織表達(dá)〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2003;23(3):279-82.

4 Luo YY，Hu WL，Xu RCH，et al.ZNF580，a novel C2H2 zinc finger transcription factor，interacts with TGF-β signaling molecule SMAD2〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(11):1153-7.

5 Wu LC.ZAS:C2H2 zinc finger proteins involved in growth and development〔J〕.Gene Expr，2002;10(4):137-52.

6 Iuchi S.Three classes of C2H2 zinc finger proteins〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001;58(4):625-35.

7 Kathryn JB，David JS.Keep your fingers off my DNA:protein-protein interactions mediated by C2H2 zinc finger domains〔J〕.Cell Biochem Biophys，2008;50:111-31.