董志珍，鄭文杰，王乃福，趙祥平，吳冬雪，王玉玲，馬 晶，賈潤清，王建華，張曉光

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300456；2.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 100052）

H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的禽類疾病，原本屬于低致病性流感病毒，長期以來僅有其來源于野鳥的報道。但2013年3月下旬，H7N9亞型禽流感病毒跨越種屬，人類感染H7N9病毒的患者在上海、江蘇，陸續(xù)又在中國多個省份被發(fā)現(xiàn)，這是該病毒全球首次感染人類。截止5月11日，全國內地共報告人感染H7N9禽流感確診病例130例，其中死亡人數33人，H7N9禽流感已經成為我國及周邊國家和地區(qū)公共衛(wèi)生機制新的考驗。同時，由于H7N9禽流感的爆發(fā)，國內家禽養(yǎng)殖業(yè)受到巨大影響，周邊國家越南和印尼已經禁止從我國進口家禽，國家和家禽養(yǎng)殖戶蒙受巨額經濟損失。據統(tǒng)計，此次人感染H7N9禽流感病毒出現(xiàn)前，全球共檢出25株H7N9亞型流感病毒，均來自野鳥，從未在家禽中發(fā)現(xiàn)，因此快速、準確的檢測家禽樣品中是否含有H7N9亞型禽流感病毒將有助于控制H7N9禽流感在人群間的傳播，并為我國的家禽養(yǎng)殖業(yè)動物及其產品的正常貿易提供強有力的技術支持。

通常，禽流感的診斷主要依靠流行病學與臨床診斷，確診依賴于病毒分離、病毒抗原與血清抗體等監(jiān)測。病毒分離和血凝抑制試驗是檢測AIV和鑒定其亞型的標準方法，但費時費力[1]。此次H7N9禽流感病毒在人群間傳播，國家流感中心及北京出入境檢驗檢疫局分別建立了用于H7N9禽流感病毒檢測的熒光定量PCR檢測方法[2]，該方法快速，靈敏度高，但該方法對人員素質及設備要求都很高，難于在基層診斷實驗室普及應用。Notomi 等開發(fā)了一種恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導等溫擴增法（loop －mediated isothermal am p l if ic at io n，LAMP），其特點是在等溫條件（65℃左右）下作用60 min 左右即可完成核酸擴增反應，更為重要的是此方法不需要貴重的儀器和試劑[3]，在水浴鍋中就能完成反應，特別適合在野外現(xiàn)場和基層部門應用[4]。近年來，LAMP 法已被成功地用于診斷發(fā)生于人類和動物的病毒性疾病，成為檢測多種致病病毒的有效工具[5-6]。我們依據H7N9 亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因序列保守區(qū)域設計了LAMP 引物，以所構建的陽性質粒為模板，建立了一種H7N9 禽流感病毒的LAMP早期快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

禽流感H7N9（安徽株）滅活病毒由國家流感中心舒躍龍教授惠贈；總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Bst DNA聚合酶、M-MULV反轉錄酶、RNA酶抑制劑購自NEB公司； 質粒小量提取試劑盒、大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司；Betaine（甜菜堿）、MgSO4購自Sigma公司。

1.2 引物的設計與合成

根據登錄于GISAID數據庫的H7N9禽流感HA基因和NA基因序列，應用生物學軟件進行序列比對，在HA和NA的保守區(qū)利用PrimerExplorer V4設計了2對引物（外引物和內引物）。熒光定量PCR所用引物和探針為國家流感中心公布，所有探針、引物的合成修飾由英俊公司完成，序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.3 RNA的提取及cDNA的制備

取經DEPC 水處理過的EP管， 加入1 mL Trizol 和200mL滅活病毒液，混勻后室溫放置5 min；加入200 mL 氯仿，用力搖晃30 s，室溫靜置3 min，4℃離心15 min，液體分層；取上層液移入干凈的EP 管， 加入500 mL 異丙醇，-20℃靜置30min，4℃離心15 min；移去上層懸液；加入1 mL 75%的DEPC 乙醇，渦旋振蕩，4℃離心10 min；去上清，空氣中干燥5 min； 向試管中加入50 mL DEPC 水。參照M-MuLV 反轉錄酶過程進行反轉錄， 得到cDNA，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性重組質粒的構建

利用針對H7N9禽流感HA基因和NA基因的特異性引物，將cDNA在50mL 體系中進行PCR擴增，得到的PCR 產物純化后克隆到pGEM-T easy載體中并轉化至大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞中，從純化擴增的重組菌中提取質粒，進行酶切鑒定，HA重組質粒用EcoRⅠ，NotⅠ雙切，NA重組質粒用sfi I單切鑒定，選取陽性重組質粒進行測序，從而為檢測提供陽性質粒，并利用此陽性質粒對LAMP 方法進行優(yōu)化。

1.5 H7N9亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增方法檢測

1.5.1 H7N9亞型禽流感病毒HA基因區(qū)的檢測

經過摸索和優(yōu)化反應條件后，建立如下擴增反應體系： 2mL cDNA樣品、5mL Bst DNA 聚合酶緩沖液（10×）、2mL Bst DNA 聚合酶（8000U/ L）、5mL dNTP（10mmol/L）、3mL Betaine（5mol/L）、6mL Mg SO4（25mmol/L）、對應于HA基因的引物 FIP和 BIP各 4mL、F3和 B3各 0.5mL、6mL H2O。混勻，65 ℃，水浴1.5h。

1.5.2 H7N9亞型禽流感病毒NA基因區(qū)的檢測

方法與HA 基因區(qū)的檢測相同， 使用的引物為對應于NA 基因區(qū)的4條特異性引物。

1.6 擴增產物的檢測

LAMP 反應結束后，取5mL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；其余擴增產物采用熒光染料法同步檢測，向擴增管中加入2mL 50倍稀釋的SYBR Green Ⅰ染料，在紫外燈和日光下觀察反應管顏色變化?；厥誋A 和NA 基因的陽性產物， 并以此為模板進行普通PCR 擴增，擴增產物送上海生工測序。

1.7 H7N9禽流感病毒HA和NA基因的檢測靈敏度

取陽性質粒DNA，經紫外分光光度計測定濃度，10倍系列稀釋后，進行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的靈敏度檢測試驗。具體試驗方案參照LAMP的常規(guī)操作程序進行。

1.8 特異性試驗

分別以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）核酸作為待測樣品，以所提取的H7N9亞型禽流感病毒質粒DNA為陽性對照，以經DEPC處理的水為陰性對照，檢驗方法的特異性。

1.9 H7N9禽流感病毒的熒光定量PCR檢測

H7N9 亞型禽流感病毒核酸的定量檢測按國家流感中心發(fā)布的“H7N9禽流感病毒熒光定量檢測標準操作規(guī)程”內容進行。同時，進行LAMP檢測作為平行對照，對結果進行分析和比較。

2 結果

2.1 H7N9 亞型禽流感病毒HA基因和NA基因的擴增

取滅活病毒液，提取病毒基因組后，參照M-MuLV 反轉錄酶過程進行反轉錄， 得到cDNA，利用特異性引物對H7N9 亞型禽流感病毒HA基因和NA基因進行擴增，結果如圖1所示，經擴增后得到HA基因1683bp，NA基因1398bp，與理論擴增值相符。

圖1 HA基因和NA基因擴增圖

2.2 陽性重組質粒的鑒定

將擴增后的HA 和NA基因，克隆到pGEM-T easy載體中并轉化至大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞中，從純化擴增的重組菌中提取質粒，進行酶切鑒定，HA重組質粒用EcoRⅠ，NotⅠ雙切，NA重組質粒用sfi I單切，結果如圖2所示。構建的HA和NA重組質粒經酶切后均得到與理論相符的目的條帶。取構建好的陽性質粒測序，測序結果顯示擴增序列與登錄于GISAID數據庫的H7N9序列一致性為100%，表明所構建的質粒確實含有目的基因片段，可以作為陽性質粒使用。

圖2 HA和NA重組質粒酶切圖

2.3 H7N9亞型禽流感病毒LAMP方法的檢測

2.3.1 凝膠電泳結果觀察

經過摸索和優(yōu)化反應條件后，建立針對H7N9亞型禽流感病毒HA基因區(qū)和NA基因區(qū)的LAMP檢測方法，檢測結果如圖3所示，HA基因區(qū)（2、3）和NA基因區(qū)（6）的擴增結果中核酸電泳條帶呈階梯狀分布，與理論結果相符，陰性對照（4、7）未見特異性產物出現(xiàn)。

2.3.2 染色結果觀察

LAMP方法擴增產物中加入2mL 50倍稀釋的SYBR Green Ⅰ進行染色，在紫外燈和日光下觀察反應管顏色變化。圖4所示，HA和NA基因陽性擴增管在可見光下呈黃綠色，陰性對照為橘紅色。圖5中，HA和NA基因陽性擴增管在紫外光下可見熒光產生，陰性對照管內無熒光產生。回收HA和NA 基因的陽性產物，進行普通PCR 擴增后測序得知，擴增序列與GISAID數據庫中的H7N9序列一致，表明LAMP方法特異性的擴增檢測H7N9病毒的HA基因和NA基因。

圖3 LAMP擴增電泳結果

圖4 LAMP擴增可見光結果

圖5 LAMP擴增紫外光結果

2.4 HA和NA基因的靈敏度試驗

取陽性質粒DNA，經紫外分光光度計測定濃度，10倍系列稀釋后，進行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的靈敏度檢測試驗。圖6和圖7中所示H7N9 禽流感病毒HA和NA 基因10 拷貝以上的稀釋度均顯示了典型的LAMP 擴增帶型，說明該檢測方法的靈敏度可達到10 個拷貝的水平。

2.5 特異性試驗

分別以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）核酸作為待測樣品，以所提取的H7N9亞型禽流感病毒質粒DNA為陽性對照，以經DEPC處理的水為陰性對照，檢驗方法的特異性。結果如圖8所示，陽性對照和陰性對照均成立，以H7N9亞型禽流感病毒所構建的質粒DNA呈陽性，其他試驗樣品呈陰性，表明試驗所用引物對H7N9亞型禽流感病毒特異性良好。

圖6 HA基因檢測靈敏度

圖7 NA基因檢測靈敏度

圖8 特異性試驗

圖9 熒光定量PCR在H7N9禽流感病毒檢測中的靈敏度測試

2.6 熒光定量PCR與所建立的LAMP方法的對比

分別以熒光定量PCR方法和LAMP方法檢測構建好的陽性重組質粒，熒光定量PCR方法檢測結果如圖9所示，靈敏度達到10個拷貝水平，與所建立的LAMP方法檢測靈敏度相同。

3 討論

環(huán)介導等溫擴增技術（ LAMP） 是一種新的核酸等溫擴增技術，原理是在目的基因片段上的多個位點上設計4條或6條引物，通常只要4條引物即可完成目的基因的擴增，如果加入另外兩條環(huán)引物，可以有效的加速整個反應過程，但反應體系內引物的增多也會增加引物二聚體的形成。LAMP 反應結果判別方法多樣， 目前常用的有電泳法、熒光法、濁度法和鈣黃綠素法[7]。濁度法和鈣黃綠素法是基于LAMP 反應產生的大量焦磷酸鹽副產物進行檢測的方法， 因此這2種方法均存在一定程度的背景干擾，且干擾強度隨反應時間延長而增加[8]；電泳法和熒光法利用雙鏈嵌合染料直接檢測擴增產物，因此背景更低，其中熒光法的陽性、陰性可用肉眼區(qū)分，對操作人員的技術要求低，更適合于現(xiàn)場快速檢測[9]。

本文采用LAMP技術建立了檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的檢測方法， 通過與中國疾控中心推薦的H7N9亞型禽流感病毒實時熒光RT - PCR 法相比較，兩種方法的檢測靈敏度相當，將106復制的病毒量質粒進行10倍系列稀釋后，實時RT- PCR 檢測和本文建立的LAMP方法檢測靈敏度均為10個拷貝；從檢測時間上看LAMP完成1次檢測可在1.5h內完成，而實時RT- PCR法則需要3h。從所需儀器上看實時RT - PCR 需要熒光定量PCR 儀，而LAMP只需恒溫水浴鍋。

綜上所述，本研究建立的H7N9亞型禽流感病毒核酸LAMP檢測方法具有特異性強、靈敏度高、方便快捷等特點，可在基層或小型實驗基地進行，同時也可應用于現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價、臨床診斷等方面，為H7N9亞型禽流感病毒檢測提供了一種新的技術與方法。

[1]Imai M， Ninomiya A， Minekawa H， et al． Development of H5－RT-LAMP（loop－mediated isothermal ampli fi cation）system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection[J]． Vaccine， 2006，24（44/46）：6679－6682．

[2]Gao R， Cao B， Hu Y， et al．Human infection with a Novel Avian-Origin Influenza A （H7N9） Virus[J].N Engl J Med，2013 ，368（20）：1888-1897.

[3]孫曉智． 口蹄疫病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與評價[D]．內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文， 2007，5：1－78．

[4]李啟明， 馬學軍， 周蕊環(huán)， 等． 環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術（RTLAMP）在丙型肝炎病毒基因檢測中的應用[J]． 病毒學報， 2006，22（5）：334－337．

[5]Manmo han P， Guillermo P， Shing oInoue， et al.Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal ampli fi cation for rapid detection of West Nile virus [J].J Clin Microbiol， 2004，42（ 1） ： 257- 263.

[6]Dukes J P， King D P， Alexandersen S.Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot- and-mouth disease virus [J].Arch Virol，2006， 151（6）： 1093- 1106.

[7]Nagamine K， Watanabe K，Ohtsuka K， et al.Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clin Chem， 2001， 47 （ 9） ： 1742-1743.

[8]Iwamoto T， Sonobe T， Hayashi K.Loop-mediated isothermal ampli fi cation for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex， M.avium， and M.intracellulare in sputum samples[J].J Clin Mi crobiol， 2003， 41（6） ： 2616-2622.

[9]Tomita N， Mori Y， Kanda H ， e t al .Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） of gene sequences and simple visual detection of products [J].Nat Protoc， 2008， 3（5） ： 877-882.