阮雁春

(江蘇省揚(yáng)州商務(wù)高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 揚(yáng)州 225127)

作為細(xì)菌的一種，乳酸菌能夠在乳糖或葡萄糖的發(fā)酵過(guò)程中生成乳酸，它對(duì)促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、幫助消化具有十分顯著的功效。此外，乳酸菌還具有發(fā)酵功能，此功能對(duì)生產(chǎn)泡菜、乳制品、干酪、發(fā)酵香腸等食品十分有幫助。對(duì)于這些專用于傳統(tǒng)食品的發(fā)酵劑研制和生產(chǎn)而言，使用乳酸菌可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，減少農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)酵時(shí)間。

發(fā)酵劑有體積小、方便運(yùn)輸、操作簡(jiǎn)單、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，不需要通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)這一傳統(tǒng)手段就能對(duì)發(fā)酵制品進(jìn)行直接生產(chǎn)，在簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝的同時(shí)，還保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，能夠控制菌種發(fā)生變質(zhì)。研制出濃縮發(fā)酵劑的重要方式就是通過(guò)對(duì)乳酸菌采用高活性、高密度培養(yǎng)。高密度培養(yǎng)技術(shù)(High Cell Density Culture，HCDC)又稱高密度發(fā)酵技術(shù)，通常是指為了提高菌體發(fā)酵密度而使液體培養(yǎng)中的細(xì)胞密度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的生長(zhǎng)狀態(tài)的技術(shù)。這樣既降低了培養(yǎng)規(guī)模，又減少了生產(chǎn)時(shí)間，不但降低了投資成本，還增強(qiáng)了產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。然而菌種不同，其高密度水平有很大差別。［1］

1 影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的因素

為了使菌體最終的種群密度最大化，需要對(duì)高密度培養(yǎng)過(guò)程的各道工序進(jìn)行合理安排。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)乳酸菌過(guò)程中選擇的培養(yǎng)基直接影響了乳酸菌的培養(yǎng)方式及生長(zhǎng)過(guò)程，限制所培養(yǎng)乳酸菌的密度，其影響因素主要是培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)時(shí)所需溫度和可能積累的各種代謝產(chǎn)物及副產(chǎn)物等。［2］

1.1 乳酸菌代謝產(chǎn)物

乳酸菌高密度培養(yǎng)過(guò)程中需要對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)分析生長(zhǎng)曲線，可以很容易得出反饋抑制作用和代謝產(chǎn)物的積累是阻礙微生物生長(zhǎng)的重要原因。三羧酸循環(huán)代謝和電子傳遞鏈會(huì)在高密度培養(yǎng)乳酸菌的過(guò)程中生成一些有害的代謝產(chǎn)物。在進(jìn)行分批培養(yǎng)過(guò)程中，也有可能由于細(xì)胞密度過(guò)高而降低菌體的適應(yīng)能力。乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的鹽類能阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)變慢，阻礙合成代謝副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。代謝產(chǎn)物的積累抑制了其生長(zhǎng)繁殖，對(duì)此應(yīng)該選擇有效方法緩解這種抑制作用，以便進(jìn)行高效生產(chǎn)。

1.2 溫度

按乳酸菌生長(zhǎng)溫度的差異將其分為中溫型及高溫型兩種，其所需最適溫度分別為30℃和37℃。條件改變，其生長(zhǎng)溫度也發(fā)生改變。對(duì)于乳酸菌來(lái)說(shuō)，不同類型乳酸菌的最適溫度范圍也存在差異。

大量實(shí)驗(yàn)表明，低于37℃乳酸菌是最佳培養(yǎng)溫度，這樣可以減少營(yíng)養(yǎng)物的攝入，減緩生長(zhǎng)速率。研究人員發(fā)現(xiàn)，在25℃ ～42℃內(nèi)，42℃最適合培養(yǎng)異體蛋白，但也有其他少數(shù)蛋白質(zhì)最佳適應(yīng)溫度是37℃或34℃，甚至更低。

不同的乳酸菌最佳生長(zhǎng)溫度不同，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中提取制備出乳酸菌，在培養(yǎng)基上進(jìn)行了溫度范圍在25℃ ～42℃之間乳酸菌最適溫度的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，乳酸菌適宜在37℃的溫度中培養(yǎng)，此溫度下可使發(fā)酵液中的菌種達(dá)到最佳生長(zhǎng)速率，增加活菌種群的密度。

圖1 溫度對(duì)乳酸菌培養(yǎng)的影響

1.3 培養(yǎng)基

碳源的差異可以影響乳酸菌的成長(zhǎng)。選擇由麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等構(gòu)成的復(fù)合糖培養(yǎng)16h，培養(yǎng)后測(cè)量活菌數(shù)和滴定酸度。試驗(yàn)結(jié)論反映，無(wú)論何種碳源都會(huì)對(duì)活菌數(shù)及滴定酸度造成顯著影響。通過(guò)對(duì)活菌數(shù)量進(jìn)行對(duì)比分析，在培養(yǎng)液中添加含低量葡萄糖的復(fù)合碳源，將麥芽糖和乳糖的比例設(shè)置為1∶1，此時(shí)乳酸的含量最高。添加麥芽糖所生成的乳酸含量較少，會(huì)阻礙乳酸菌的生長(zhǎng)，所以將乳糖和麥芽糖按比例添加才能夠保證正常的pH值環(huán)境。

將乳酸菌進(jìn)行冷凍和干燥發(fā)現(xiàn)，若要使菌體細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量提高，可增加乳酸菌在凍干過(guò)程中的存活率，增強(qiáng)乳酸菌中細(xì)胞活性。將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)至低于最適溫度10℃，可使乳酸菌細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸和不溶性多糖含量增加，同樣可以提高菌體的凍干存活率;為了使乳酸菌細(xì)胞在凍干過(guò)程中大量存活，一般可通過(guò)使用諸如NH3·H2O以及Ca(OH)2等堿類物質(zhì)來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程中pH值的調(diào)節(jié)，以此來(lái)保證培養(yǎng)基中的酸度不會(huì)太高;而為了使乳酸菌菌體在凍干過(guò)程中大量存活，一般都會(huì)在細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或者是生長(zhǎng)到穩(wěn)定生長(zhǎng)初期進(jìn)行收獲。

1.4 pH值

實(shí)驗(yàn)得出，最適合乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的pH環(huán)境為6.5～7.0，乳酸菌在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)時(shí)會(huì)生成許多有機(jī)酸，當(dāng)其產(chǎn)生到一定數(shù)量時(shí)能夠阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此通過(guò)控制培養(yǎng)基pH值的變化幅度及提高培養(yǎng)基的緩沖能力會(huì)對(duì)細(xì)胞數(shù)目的增加有顯著的調(diào)節(jié)作用。pH值發(fā)生變化是由于乳酸菌代謝產(chǎn)物的不同造成的，因此查看pH值的變化也可以作為依據(jù)，將其結(jié)合，完善高密度培養(yǎng)的發(fā)酵過(guò)程。在進(jìn)行自助添加新的培養(yǎng)液的培養(yǎng)方式中，調(diào)節(jié)pH值的主要方法是連續(xù)添加新的培養(yǎng)料，保證其最適的pH值環(huán)境，從而達(dá)到高密度繁殖的目的。

在對(duì)培養(yǎng)基中的pH值進(jìn)行測(cè)定的過(guò)程中，首先應(yīng)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值設(shè)置到5.5～7.0之間，16h后分別測(cè)量起始pH值不同的培養(yǎng)基中活菌的數(shù)目。通過(guò)實(shí)驗(yàn)很容易看出，起始的pH值不能過(guò)高或過(guò)低，否則會(huì)阻礙乳酸菌生長(zhǎng)，并且可以知道培養(yǎng)基的最適pH值為6.5，因此可以在試驗(yàn)中適當(dāng)設(shè)置起始pH值，使其處于略高水平，可以有效避免pH值的快速降低。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，我們繪制了pH值對(duì)乳酸菌培養(yǎng)的影響曲線，如圖2所示，可見(jiàn)不同pH值下乳酸菌的生長(zhǎng)速度是不同的，適時(shí)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值可以高效維持乳酸菌健康生長(zhǎng)，使pH值保持在6.0－6.5之間效果較為明顯。［3］

圖2 pH值對(duì)乳酸菌培養(yǎng)的影響曲線

2 高密度濃縮乳酸菌的培育方法

濃縮培養(yǎng)的基本原理是:通常采用調(diào)節(jié)pH值、清除代謝產(chǎn)物以及添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)排出代謝產(chǎn)物解決乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用。目前，有以下幾種濃縮培養(yǎng)乳酸菌的方法可供選擇［4］:

2.1 緩沖鹽法

為了最大程度地加快乳酸菌的繁殖和生長(zhǎng)，需要找到最適合的生長(zhǎng)繁殖酸度，這就要加入緩沖鹽制劑，來(lái)調(diào)節(jié)乳酸菌培養(yǎng)液的酸度，使其在一定的范圍內(nèi)發(fā)生變化。

2.2 中和法

乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，為了使乳酸菌大量繁殖，需要使培養(yǎng)液的pH值達(dá)到穩(wěn)定值，通常做法是向培養(yǎng)液中添加一些堿類物質(zhì)中和。［5］

2.3 膜滲析法

為了使乳酸菌較快繁殖，可以不斷地在乳酸菌培養(yǎng)液中添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此過(guò)程產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物會(huì)通過(guò)膜除去。中和法以及緩沖鹽法的研究及應(yīng)用極為常見(jiàn)，膜滲析法雖然對(duì)相關(guān)操作技術(shù)以及膜材料的要求很高，但它仍舊是多種濃縮培養(yǎng)乳酸菌方法中較為先進(jìn)的方式。實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了達(dá)到緩沖的效果而利用高濃度的磷酸鹽以及蛋白，要使用到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21% ～28%的脫脂乳和超濾濃縮奶作為培養(yǎng)液;將緩沖鹽A加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂乳水解液培養(yǎng)基中，并且將緩沖鹽B加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳培養(yǎng)基中，在40℃溫度環(huán)境下培養(yǎng)8h和6h，乳酸菌活菌數(shù)分別達(dá)到2.2×10mL和6.5×10mL，是不加緩沖鹽時(shí)的3倍;相關(guān)人員在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的脫脂乳、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%酵母膏培養(yǎng)基中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的 KHPO鹽，設(shè)置溫度為42℃，維持時(shí)間4h，能使活菌數(shù)達(dá)到2.95×10ml，是起初數(shù)目的兩倍，然后在溶液中添加含量為30%的 Na2CO3，維持pH值在6.3附近，溫度在42℃繼續(xù)培養(yǎng)6h，能使乳酸菌中的活菌數(shù)達(dá)到5.89×10ml。由以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)在濃縮培養(yǎng)乳酸菌時(shí)使用化學(xué)中和法和緩沖鹽法具有顯著效果，能夠使菌體的數(shù)量明顯增長(zhǎng)。［6］

3 培養(yǎng)高密度的乳酸菌廣闊發(fā)展前景及展望

當(dāng)前，高密度乳酸菌的研發(fā)在國(guó)內(nèi)還是一個(gè)新興的領(lǐng)域，特別是在這種直接使用型發(fā)酵劑相對(duì)缺少的時(shí)候。而作為擁有巨大市場(chǎng)潛力的發(fā)酵劑，包括大豆制品、蔬菜肉類及酒類在內(nèi)的優(yōu)良直投型發(fā)酵劑，更重要的是使用優(yōu)良發(fā)酵劑可使發(fā)酵食品的生產(chǎn)成本降低，提高了發(fā)酵食品的安全性。［7］乳酸的開(kāi)發(fā)潛力非常巨大，對(duì)乳酸菌進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)該注意以下方面:

第一，對(duì)我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的作用規(guī)律進(jìn)行分析研究，探索提取制備生長(zhǎng)迅速、性能良好穩(wěn)定、食用安全的乳酸菌新菌種。

第二，應(yīng)用現(xiàn)代微生物高科技手段，先進(jìn)膜工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)行研究，可在制備研究乳酸菌的培養(yǎng)以及發(fā)酵劑時(shí)，為以后工作提供很好的保障。為了使在單位體積內(nèi)乳酸菌的活菌含量增加，使得培養(yǎng)高密度乳酸菌的高效技術(shù)變得更為重要。

第三，新型的發(fā)酵劑制備工藝的研究，對(duì)乳酸菌的制備工藝具有深遠(yuǎn)意義。由于現(xiàn)代生物技術(shù)的廣大前景，濃縮型發(fā)酵劑的制備和乳酸菌的高密度培養(yǎng)等技術(shù)在國(guó)際上具有非常廣闊的市場(chǎng)。只有更加系統(tǒng)全面地學(xué)習(xí)和研究乳酸菌的遺傳學(xué)和生理學(xué)等方面的知識(shí)，才能夠生產(chǎn)出優(yōu)良的乳酸菌制品，走向新時(shí)代乳酸菌發(fā)酵工業(yè)的光明前景。

［1］孟祥晨，等.乳酸菌與乳品發(fā)酵劑［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.

［2］張剛.乳酸細(xì)菌:基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［3］涂展.濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑的制備［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2007(5):79－82.

［4］張帥震.發(fā)酵乳及新型發(fā)酵劑的研究概述［J］.中國(guó)奶牛，2009(1):8－10.

［5］強(qiáng)亮生，等.食品添加劑與功能性食品:配方·制備·應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出社，2010.

［6］霍貴成.乳酸菌的研究與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.

［7］郭興華.益生乳酸細(xì)菌:分子生物學(xué)及生物技術(shù)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.