陳獻(xiàn)珊 韓坤元 陳鋒夏 吳從明 黃偉煒

肺癌占全球癌癥死亡的首位。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌總數(shù)超過(guò)80%，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。深入了解肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，并探討其防治策略尤為必要。近年來(lái)研究[1,2]發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物除了具有抗瘧作用外，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞在體外具有殺傷或抑制作用，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。多項(xiàng)研究[3,4]證實(shí)青蒿素衍生物之一—青蒿琥酯可抑制肺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究繼續(xù)觀察低濃度青蒿琥酯對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響和對(duì)細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）蛋白表達(dá)的影響，以期為NSCLC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物及試劑 人NSCLC A549細(xì)胞株購(gòu)于中南大學(xué)腫瘤研究所。SPF級(jí)BALB/C-nu/nu品系裸鼠購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。青蒿琥酯購(gòu)于桂林南藥股份有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)H-10930195），用5%碳酸氫鈉注射液溶解超濾除菌后，再用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成不同終濃度備用。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司。胰蛋白酶、MTT（噻唑藍(lán)）和DMSO（二甲基亞砜）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司。ICAM-1和MMP-9兔多抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL。置于37oC、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，以每孔200 μL接種于96孔板，每組6復(fù)孔。分別加入終濃度為0 μg/L、1.25 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L和20 μg/L的青蒿琥酯50 μL， 置37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。離心去上清，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，37oC培養(yǎng)4 h后，加入現(xiàn)配的DMSO，振蕩溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處吸光度。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，分別加0 μg/L、1.25 μg/L、2.5 μg/L和5 μg/L的青蒿琥酯作用24 h，胰蛋白酶消化，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，各組分別吸取200 μL接種于上層小室，將其置于滅菌的24孔板。下室加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h。將上室面的Matrigel和細(xì)胞用濕棉簽擦掉，膜用甲醇固定10 min，蘇木精染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，求其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 裸鼠A549細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 于裸鼠右后肢皮下接種A549細(xì)胞0.2 mL（約含活細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)），約1周后長(zhǎng)出腫塊。取已成瘤小鼠20只，隨機(jī)分成4組。參考文獻(xiàn)[5]分別腹腔注射低濃度青蒿琥酯10、20和40 mg/kg，對(duì)照組注射等量生理鹽水。每日1次，連續(xù)注射14天。于最后一次給藥治療12 h后無(wú)痛處死小鼠，取出移植瘤并稱重。計(jì)算抑瘤率。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 分別將各組移植瘤標(biāo)本勻漿，提取總蛋白，蛋白定量，取15 μL樣品加入等體積2×上樣緩沖液，煮沸5 min備用。取100 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉液孵育2 h，加入相應(yīng)一抗4oC過(guò)夜（β-actin為內(nèi)參），漂洗后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，化學(xué)發(fā)光顯色。IPP光密度分析軟件進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩均數(shù)比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊者用t檢驗(yàn)。多組間數(shù)值資料比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用 青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。青蒿琥酯終濃度＞5 μg/L時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；青蒿琥酯終濃度≤5 μg/L時(shí)，在24 h內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯毒性作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），A549細(xì)胞存活率超過(guò)90%（表1）。后續(xù)Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)采用較低濃度青蒿琥酯（≤5 μg/L）。

2.2 青蒿琥酯抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)（96.33±6.41）相比，青蒿琥酯1.25 μg/L組、2.5 μg/L組及5 μg/L組的侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)明顯減少，分別為（75.43±4.37）（P＜0.05）、（61.43±3.61）（P＜0.01）和（39.31±3.41）（P＜0.01）（圖1）。

2.3 青蒿琥酯對(duì)裸鼠A549細(xì)胞移植瘤的影響 經(jīng)低濃度青蒿琥酯處理后，各劑量組移植瘤瘤重均較對(duì)照組減輕。其中青蒿琥酯20 mg/kg組（0.52±0.05）g和40 mg/kg組（0.37±0.03）g的瘤重與對(duì)照組（0.69±0.05）g相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；10 mg/kg青蒿琥酯組瘤重（0.62±0.04）g與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖2）。隨青蒿琥酯劑量的增加，對(duì)移植瘤的抑制率有增大趨勢(shì)。各劑量組的抑瘤率分別為8.69%（10 mg/kg組）、24.74%（20 mg/kg組）和43.09%（40 mg/kg組）。

2.4 青蒿琥酯對(duì)裸鼠A549細(xì)胞移植瘤ICAM-1和MMP-9蛋白表達(dá)影響 Western印跡結(jié)果顯示，經(jīng)青蒿琥酯處理后，10 mg/kg青蒿琥酯組即開始出現(xiàn)ICAM-1和MMP-9蛋白表達(dá)量降低。與對(duì)照組相比，ICAM-1蛋白表達(dá)分別降低16.67%（10 mg/kg組）、40.48%（20 mg/kg 組）和58.91%（40 mg/kg組）；MMP-9蛋白表達(dá)分別降低21.05%（10 mg/kg組）、41.52%（20 mg/kg組）和66.31%（40 mg/kg組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

表 1 青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞增殖率的影響（Mean±SD, n＝6）Tab 1 The proliferation-inhibiting effect of artesunate on A549 cells (Mean±SD, n＝6)

圖 1 不同濃度青蒿琥酯對(duì)肺癌A548細(xì)胞侵襲、遷移的影響。A：0 μg/L青蒿琥酯組；B：1.25 μg/L青蒿琥酯組；C：2.5 μg/L青蒿琥酯組；D：5 μg/L青蒿琥酯組。Fig 1 Effects of artesunate with different doses on migration and invasion of lung cancer A459 cells. A: 0 μg/L artesunate group; B: 1.25 μg/L artesunate group; C: 2.5 μg/L artesunate group; D: 5 μg/L artesunate group.

3 討論

青蒿素是我國(guó)科學(xué)家開發(fā)的具有完全知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗瘧藥。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物之一，具有更好的水溶性和抗瘧效果。研究[2,6]表明青蒿素及其衍生物除有抗瘧作用外，還具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等生物學(xué)作用。目前青蒿素及其衍生物表現(xiàn)出的強(qiáng)大抗腫瘤活性越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者注意。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的研究[1]表明：青蒿琥酯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等55種惡性腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。多項(xiàng)研究[3,4]亦證實(shí)青蒿琥酯可以劑量依賴方式抑制體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究以較低濃度青蒿琥酯作用于裸鼠A549細(xì)胞移植瘤模型，觀察青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度的青蒿琥酯即對(duì)移植瘤有一定抑制作用。進(jìn)一步提示青蒿琥酯可能是一種潛在的抗肺癌藥物選擇。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。NSCLC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率更是居于原發(fā)性惡性腫瘤的前列。從分子水平深入了解肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，并探討其防治策略尤為必要。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，從分子水平可概括為粘附、蛋白降解和移動(dòng)三個(gè)步驟。腫瘤細(xì)胞首先粘著于細(xì)胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮、靶器官細(xì)胞等處。然后分泌水解酶，降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)及毛細(xì)血管基底膜等。突破限制后浸入周圍組織器官或進(jìn)入血循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，最終形成轉(zhuǎn)移灶。目前關(guān)于青蒿琥酯對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響較少有報(bào)道。在炎癥、纖維化等的研究[7-9]中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯具有調(diào)節(jié)蛋白水解酶表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解的作用。鑒于此，本研究首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，得到青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用的濃度范圍，然后以較低濃度青蒿琥酯進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察較低濃度青蒿琥酯對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞侵襲能力隨著青蒿琥酯濃度增加而逐漸降低。提示青蒿琥酯對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用可能也與其降低肺癌細(xì)胞侵襲能力有關(guān)。

圖 2 不同劑量青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞移植瘤瘤重影響（Mean±SD, n＝5）（*P＜0.01, 與對(duì)照組比較）Fig 2 The effect of artesunate with different doses on the heavy of A549 cell xenograft tumor (Mean±SD, n＝5) (*P＜0.01, when compared with control group)

圖 3 不同劑量青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞移植瘤ICAM-1和MMP-9蛋白表達(dá)影響（Mean±SD, n=6）（*P＜0.05, 與對(duì)照組比較）Fig 3 The effect of artesunate with different doses on the ICAM-1 and MMP-9 expression in A549 cell xenograft tumor (Mean±SD, n=6) ( *P＜0.05,when compared with control group)

ICAM-1和MMP-9是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中非常重要的兩個(gè)細(xì)胞因子。ICAM-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜表面，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘附；同時(shí)也介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞-淋巴細(xì)胞粘附，使腫瘤細(xì)胞易于隨淋巴細(xì)胞遷移進(jìn)入血循環(huán)或淋巴循環(huán)，增加腫瘤遷移浸潤(rùn)的機(jī)會(huì)。ICAM-1在多種類型的腫瘤組織中存在異常表達(dá)[10]。針對(duì)NSCLC患者的研究[11,12]發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在NSCLC組織中高表達(dá)，且其表達(dá)量與肺癌不同分期、侵襲轉(zhuǎn)移和病理類型等密切相關(guān)。本研究亦證實(shí)在體內(nèi)A549細(xì)胞移植瘤中存在ICAM-1高表達(dá)。提示ICAM-1與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶類，同時(shí)還具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白IV型膠原，在膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)腸癌等多種侵襲性強(qiáng)的惡性腫瘤中高表達(dá)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9不光高度表達(dá)于肺癌組織中，在患者血清水平亦存在顯著升高，是NSCLC患者早期診斷和預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)[13,14]。抑制體外培養(yǎng)的H1299肺癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)，則能抑制其早期轉(zhuǎn)移[15]。本研究亦發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)A549細(xì)胞移植瘤中存在MMP-9高表達(dá)。鑒于ICAM-1和MMP-9與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系，本研究觀察了較低濃度青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤內(nèi)ICAM-1和MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度青蒿琥酯（10 mg/kg）即可下調(diào)移植瘤內(nèi)ICAM-1和MMP-9表達(dá)量，提示青蒿琥酯對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響可能與其抑制ICAM-1和MMP-9表達(dá)有關(guān)。