田建嶺 劉曉靈 孫 琳 焦偉偉 肖 婧 尹青琴 吳喜蓉 郭雅潔 韓 銳 李勤靜申阿東

結(jié)核病( TB) 目前仍是全球公共衛(wèi)生的主要問題［1］。γ干擾素釋放試驗( IGRAs) 通過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原( ESAT-6 和CFP-10) 刺激外周血單個核細胞釋放的γ 干擾素，明確有無結(jié)核分枝桿菌感染，不會與卡介苗接種和其他環(huán)境分枝桿菌感染產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異度優(yōu)于結(jié)核菌素皮試［2，3］。目前有兩種商業(yè)化的試劑盒用于體外檢測γ 干擾素，一種是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗( ELISA) 法，檢測全血γ干擾素濃度，如QFT-GIT； 另一種是基于酶聯(lián)免疫斑點( ELISPOT) 方法檢測結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T 細胞斑點數(shù)( 簡稱T 細胞斑點數(shù)) ，如結(jié)核感染T 細胞斑點實驗( T.SPOT.TB) ，其敏感度優(yōu)于ELISA 方法［4］。

IGRAs 檢測的結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T 細胞經(jīng)特異性抗原刺激后釋放的γ 干擾素，在活動性TB 與潛伏結(jié)核感染( LTBI) 中均有釋放，目前認為IGRAs 不能區(qū)分活動性TB 與LTBI，但兩者是結(jié)核分枝桿菌感染的不同階段。既往對TB 患兒在不同的抗結(jié)核治療階段應(yīng)用ELISPOT 進行檢測，發(fā)現(xiàn)T 細胞斑點數(shù)隨治療時間延長有逐漸下降趨勢［5，6］，提示T 細胞斑點數(shù)的數(shù)量與感染的狀態(tài)有關(guān)。本研究應(yīng)用T.SPOT.TB 對兒童活動性TB 與LTBI 的T 細胞斑點數(shù)的分布情況進行分析，試圖回答T 細胞斑點數(shù)在兒童活動性TB 與LTBI 間是否存在差異，是否可找到適當(dāng)?shù)陌唿c數(shù)界值以區(qū)分兒童活動性TB 與LTBI。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院( 我院)結(jié)核病病房和門診診斷為活動性TB 或LTBI 的0 ～18 歲行T.SPOT.TB 檢查結(jié)果陽性且未經(jīng)過抗結(jié)核治療的病例。

1.2 排除標(biāo)準 ①長期使用免疫抑制劑，如糖皮質(zhì)激素等；②合并有其他重大疾病，如白血病、HIV 感染等。

1.3 倫理和知情同意 本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，行T.SPOT.TB 檢查為臨床需要，不會對研究對象產(chǎn)生不利影響。

1.4 診斷標(biāo)準

1.4.1 TB 診斷標(biāo)準 肺結(jié)核診斷參考《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準和治療方案( 試行) 》［7］，肺外結(jié)核參考《實用小兒結(jié)核病學(xué)》［8］。其中具有典型的臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，同時經(jīng)病原學(xué)或組織病理學(xué)證實者，即為確診病例； 具有典型的臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，同時具有活動性TB 接觸史、PPD 試驗陽性、抗結(jié)核治療有效、排除其他肺部疾病4 項中任意2 項者，即為臨床診斷病例。結(jié)核性腦膜炎與血行播散型TB 為重癥TB［9］，余為非重癥TB。

1.4.2 LTBI 的診斷標(biāo)準 T. SPOT. TB 和( 或) PPD 皮試結(jié)果陽性( 除外卡介苗接種反應(yīng)) ，且無TB 的相關(guān)臨床表現(xiàn)及X 線胸片無TB 特征的患兒。

1.5 分組考慮 依據(jù)本文試圖回答的T 細胞斑點數(shù)在兒童活動性TB 與LTBI 間是否存在差異，將進入分析的病例分為活動性TB 組和LTBI 組，由于活動性TB 中包含重癥TB 和非重癥TB，活動性TB 組T 細胞斑點數(shù)是否會受到重癥TB 和非重癥TB 的影響，因此在活動性TB 組中再分為重癥TB 亞組和非重癥TB 亞組。

1.6 實驗操作

1.6.1 PPD 試驗 患兒前臂皮內(nèi)注射0.1 mL( 含5 U 的PPD) ，注射后48 ～72 h 測量皮試硬結(jié)大小。記錄硬結(jié)平均直徑=( 橫徑+ 縱徑) /2，反應(yīng)大小以mm 記錄。PPD 試驗陽性判斷標(biāo)準依據(jù)文獻［8］：原發(fā)或繼發(fā)免疫功能低下、營養(yǎng)不良和重癥TB 患兒以≥5 mm 為陽性； 其他患兒以≥10 mm為陽性，同時能除外卡介苗接種后的免疫反應(yīng)。

1.6.2 IGRAs 操作按T 細胞檢測試劑盒說明書［4］進行( T.SPOT.TB) ，取外周靜脈血2 ～4 mL，室溫下放置并于4 h內(nèi)進行試驗，用無菌淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，向微孔培養(yǎng)板4 個孔中分別加入50 μL 細胞培養(yǎng)液( 空白對照) 、ESAT-6( 抗原A) 、CFP-10( 抗原B) 和PHA( 陽性質(zhì)控對照液) ，每個孔中加入100 μL 細胞終溶液( 含有25 萬個活細胞) ，將微孔培養(yǎng)板置于37℃5%的CO2培養(yǎng)中孵育16 ～20 h，應(yīng)用1 × PBS 洗板，加入二抗置于4℃1 h，顯色底物進行顯色，使用酶聯(lián)斑點圖像自動分析儀進行斑點計數(shù)。

T.SPOT.TB 陽性判斷標(biāo)準： 滿足以下任一項，①空白對照孔斑點數(shù)為0 ～5 個且( 抗原A 或抗原B 孔斑點數(shù)) -( 空白對照孔斑點數(shù)) ≥6； ②空白對照孔斑點數(shù)為6 ～10且( 抗原A 或抗原B 孔的斑點數(shù)) ≥2 ×( 空白對照孔斑點數(shù)) 。

陰性判斷標(biāo)準： 陽性質(zhì)控對照孔結(jié)果良好( 斑點數(shù)≥20) ，但抗原A 或抗原B 孔斑點數(shù)均達不到陽性標(biāo)準。

T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)為分別計算抗原A 和B孔與空白對照孔差值，取最大值； 抗原A 和B 孔T 細胞斑點數(shù)為相應(yīng)抗原孔斑點數(shù)與空白對照孔的差值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 活動性TB 組( 重癥和非重癥TB 亞組)與LTBI 組T 細胞斑點數(shù)用中位數(shù)( 范圍) 表示，組間斑點數(shù)比較采用Mann-Whitney U 秩和檢驗，組內(nèi)T 細胞斑點數(shù)比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。ROC 曲線分析T. SPOT. TB抗原孔T 細胞斑點數(shù)，尋找區(qū)分活動性TB 與LTBI 的最佳界值，計算曲線下面積( AUC) 、敏感度和特異度及其95%CI。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 17.0軟件行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5.0 用于作垂直散點圖。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 圖1 顯示，2011 年1 月至2012 年8 月依據(jù)本文納入和排除標(biāo)準進入分析的活動性TB 和LTBI 病例共140 例。活動性TB 組與LTBI 組病例的基本臨床信息如表1 所示，活動性TB 組19 例為病原學(xué)確診病例，余為臨床診斷病例。重癥TB 亞組27 例，非重癥TB 亞組66 例。

圖1 病例篩選入組流程圖Fig 1 Flow chart of case selection process

表1 研究對象信息( n)Tab 1 Characteristics of pediatric patients studied( n)

圖2 顯示，活動性TB 組T 細胞斑點數(shù)中位數(shù)為84(6 ～710) ，顯著高于LTBI 組的17(6 ～316) ，P =0.000； 非重癥TB 亞組T 細胞斑點數(shù)中位數(shù)為99( 6 ～710) ，顯著高于重癥TB 亞組的44(6 ～268) 和LTBI 組的17(3 ～316) ，P分別為0.011 和0.000；重癥TB 亞組T 細胞斑點數(shù)和LTBI組差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P=0.084) ，但4 組間T 細胞斑點數(shù)有較大范圍重疊?？乖瑼 孔和抗原B 孔T 細胞斑點數(shù)中位數(shù)在活動性TB 組和LTBI 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，抗原A 孔：46( -1 ～557) vs 13( 0 ～316) ，P =0.000； 抗原B 孔：35( -3 ～710) vs 12(2 ～297) ，P =0.001；抗原A 孔T 細胞斑點數(shù)中位數(shù)在兩組中均高于抗原B 孔，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義( 活動性TB 組P=0.926，LTBI 組P=0.541) 。

表2 顯示，區(qū)分活動性TB 和LTBI，T.SPOT.TB、抗原A和抗原B 孔T 細胞斑點數(shù)ROC AUC 分別為0.731(95%CI：0.642 ～0.819) ，0.725(95%CI：0.638 ～0.811) 和0.680(95%CI：0.587 ～0.774) ；區(qū)分非重癥TB 和LTBI，重癥TB 和LTBI，重癥TB 和非重癥TB 的ROC AUC 分別為0.775 (95%CI：0.688 ～0.863) ，0.621( 95%CI： 0.486 ～0.757) ，0.668(95%CI，0.549 ～0.787) 。以T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)區(qū)分LTBI 與活動性TB 的準確性最佳，T 細胞斑點數(shù)界值為43.5，敏感度與特異度分別為69.9%和70.2%；區(qū)分非重癥TB 和LTBI 的T 細胞斑點數(shù)界值為44，敏感度和特異度分別為77.3%和70.2%，區(qū)分非重癥TB 和重癥TB 的T 細胞斑點數(shù)界值為44.5，敏感度和特異度分別為77.3%和51.9%。

圖2 活動性TB、重癥和非重癥TB、LTBI 患兒T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)比較Fig 2 Dot plots of effector T-cell spots above negative control in children with active TB，severe TB，non-severe TB and LTBI

表2 活動性TB、重癥TB、非重癥TB 和LTBI 兒童T 細胞斑點數(shù)ROC 曲線分析Tab 2 ROC curve analysis of T. SPOT. TB spots among children with active TB，severe and non-severe TB and LTBI

隨T 細胞斑點數(shù)界值取值的增大，區(qū)分LTBI 與活動性TB 的敏感度逐漸降低，特異度、陽性似然比和陰性似然比逐漸升高( 表3) 。

表3 不同T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)界值區(qū)分兒童活動性TB與LTBI 的敏感度、特異度及似然比Tab 3 Sensitivity，specificity and LR of different cut-off values in differentiating active TB from LTBI

3 討論

本研究對T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)分析顯示，活動性TB 組T 細胞斑點數(shù)中位數(shù)顯著高于LTBI 組(84 vs 17) ，其中非重癥TB 亞組( 99) 顯著高于重癥TB 亞組( 44) 和LTBI 組(17) ，提示活動性TB 與LTBI 組T 細胞斑點數(shù)的差異主要源于非重癥TB。T 細胞斑點數(shù)在活動性TB 組明顯高于LTBI 組，提示其數(shù)量可從一定程度上反映了體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌負荷的程度，進一步的ROC 曲線分析顯示，T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)的AUC( 0.731) 高于抗原A 孔(0.725) 和抗原B 孔(0.680) ，提示區(qū)分活動性TB 與LTBI的準確性以T.SPOT.TB 最佳，相應(yīng)的斑點數(shù)界值為43.5，敏感度和特異度分別為69.9%和70.2%。另外，從表3 可見隨T 細胞斑點數(shù)界值增大，其區(qū)分活動性TB 與LTBI 的特異度逐漸升高，界值為185 時的特異度達95.7%，較高的特異度對臨床診斷兒童活動性TB 具有一定的指導(dǎo)意義。

Latorre 等［10］應(yīng)用T. SPOT. TB 的研究顯示，T 細胞斑點數(shù)在兒童活動性TB(12 例) 與LTBI(61 例) 間無顯著性差異，ROC AUC 為0.596，T 細胞斑點數(shù)界值為145 對應(yīng)的敏感度和特異度分別為25%和80%，作者考慮與兒童結(jié)核感染通常為近期感染，機體反應(yīng)程度在活動性TB 和LTBI間相似有關(guān)。本研究以T 細胞斑點數(shù)界值特異度≥80%作為區(qū)分活動性TB 與LTBI 的理想界值時，其敏感度是文獻［10］的近2 倍(47.3% vs 25%) ，而T 細胞斑點數(shù)界值較低(94.5 vs 145) ，考慮可能與入組人數(shù)(73 vs 140) 、活動性TB 和LTBI 人數(shù)比例(12/61 vs 93/47) 以及PPD 試驗陽性比例的不同有關(guān)。成人研究顯示T 細胞斑點數(shù)在PPD 試驗陽性組高于陰性組，將兩者合并分析時界值低于僅分析PPD 試驗陽性人群［10］。

T 細胞斑點數(shù)在成人活動性TB 亦顯著高于LTBI( P ＜0.001) ，但也因T 細胞斑點數(shù)分布在兩人群間有較大范圍的重疊，而 不 能 區(qū) 分 活 動 性TB 與LTBI［10～12］。Latorre等［10］和Janssens［12］等應(yīng)用ROC 曲線分析尋找區(qū)分活動性TB 和LTBI 的T 細胞斑點數(shù)界值，文獻［10］( 活動性TB 37例，LTBI 85 例) 顯示以抗原A 孔T 細胞斑點數(shù)區(qū)分活動性TB 與LTBI 最佳( AUC 0.677) ，以T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)區(qū)分活動性TB 與LTBI 的最佳界值為50，敏感度為70.3%，特異度為56.5%。文獻［12］( 活動性TB 57 例，LTBI 127 例) 顯示以T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)的準確性最佳( AUC 0.805) ，界值為49.5，敏感度和特異度分別為82.8%和74.2%，兩研究間結(jié)果的不一致可能與入組研究對象人數(shù)不同有關(guān)。本研究也顯示，T.SPOT.TB 的T 細胞斑點數(shù)分布在活動性TB(6 ～710) 、重癥TB(6 ～268) 、非重癥TB(6 ～710) 和LTBI(3 ～316) 間有較大范圍重疊，提示不能用T 細胞斑點數(shù)的數(shù)量區(qū)分活動性TB 和LTBI，也不能區(qū)分重癥和非重癥TB，與成人研究結(jié)果一致。但菌負荷多的重癥TB 亞組T 細胞斑點數(shù)比非重癥TB 少，考慮與高菌負荷的個體體內(nèi)抗原特異性T 細胞產(chǎn)生效率較低有關(guān)［13］。

本研究入組的研究對象多數(shù)在T. SPOT. TB 檢測前已行PPD 試驗，但間隔時間未超過3 d，因PPD 試驗先于T.SPOT.TB 有可能產(chǎn)生復(fù)強效應(yīng)干擾T 細胞斑點計數(shù)。成人研究顯示PPD 試驗對IGRAs 的影響主要出現(xiàn)在PPD 陽性人群［14～18］，PPD 試驗后3 d 內(nèi)查IGRAs 是安全的［15，18］，而皮試后第7 天的γ 干擾素濃度和T 細胞斑點數(shù)較皮試當(dāng)日有明顯升高［18］。Richeldi 等［19］對有結(jié)核病暴露史的兒童同時應(yīng)用PPD、QFT-G(70 例) 與QFT-GIT(81 例) 進行篩查，并在8 ～11 周后復(fù)查QFT，未發(fā)現(xiàn)PPD 試驗前后γ 干擾素水平有明顯變化，認為不會造成IGRAs 的假陽性反應(yīng)。

4 結(jié)論

兒童活動性TB 尤其是非重癥TB 的T 細胞斑點數(shù)顯著高于LTBI 兒童，T 細胞斑點的數(shù)量從一定程度上反映了體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌負荷程度；因T 細胞斑點數(shù)在活動性TB與LTBI 間有較大范圍重疊，且其界值區(qū)分兩者的敏感度和特異度均較低，故不適用于兒童LTBI 與活動性TB 的鑒別診斷。

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