唐海深 滿婷婷 江陵 張金云 李東至

（1.中山市博愛醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，廣東 中山 528400；2.清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，廣東 清遠(yuǎn) 511518；3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623）

α-地中海貧血（簡稱α-地貧）是由于α-珠蛋白基因缺失或突變使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血。臨床上分為靜止型、標(biāo)準(zhǔn)型、Hb H病和血紅蛋白Bart′s胎兒水腫綜合征4種類型，其分子機(jī)制分別為1、2、3、4個α基因缺陷（缺失或突變）。血紅蛋白Bart′s胎兒水腫綜合征（主要由—SEA純合子引起），胎兒一般在妊娠23～38周或出生后數(shù)小時死亡。因此在α-地貧高危地區(qū)進(jìn)行人群篩查，是識別高危人群、預(yù)防重型地貧患兒出生的重要手段。正常胎兒和新生兒的血紅蛋白成分主要是 HbF（α2γ2），若α-珠蛋白鏈減少或缺乏會導(dǎo)致γ-珠蛋白鏈的相對增多，聚合成Hb Bart′s（γ4），因此，臍血中 Hb Bart′s與α-地貧直接相關(guān)。目前應(yīng)用較多的Hb Bart′s檢測方法有：瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳。本文同時應(yīng)用毛細(xì)管電泳與瓊脂糖凝膠電泳篩查新生兒α-地貧，比較2種方法的價值。此外，本研究通過采用HRM技術(shù)篩查3種常見非缺失型α-地貧以探討該技術(shù)的實(shí)用價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象 2010年6～12月在清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院產(chǎn)科分娩的1442例新生兒。

1.2 標(biāo)本采集 新生兒分娩斷臍后，從胎盤端臍帶抽吸2ml臍帶血，放入EDTA.K2抗凝管，用于血紅蛋白電泳及地貧基因檢測。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳Hb Bart′s定量 采用美國Helena Laboratories公司的電泳儀進(jìn)行臍帶血瓊脂凝膠Hb電泳分析，經(jīng)染色后在Optiscan光密度掃描儀上進(jìn)行區(qū)帶掃描定量。

1.4 毛細(xì)管電泳Hb Bart′s定量 臍血樣品先3000轉(zhuǎn)離心3分鐘，取18μl血細(xì)胞溶于90μl的溶血素中充分混勻后上機(jī)檢測。采用法國Sebia公司Capillarys 2全自動毛細(xì)管電泳儀及配套試劑，在9.8 k V電壓、p H 9.4的堿性緩沖液條件下，在石英毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行血紅蛋白電泳，用415 nm波長檢測各種血紅蛋白的百分比，從而定量Hb Bart′s。電泳圖譜分成15個區(qū)：不同的血紅蛋白峰出現(xiàn)在特定的區(qū)域內(nèi)：Hb A2＝Z3，Hb F＝Z7，Hb A＝Z9，Hb Bart＇s＝Z12，Hb H＝Z15［1，2］。

1.5 基因分型

1.5.1 DNA提取 收集任意一種電泳方法篩查Hb Bart′s陽性的樣本，用富士quick genemini80DNA提取儀，按DNA提取試劑盒使用說明，提取新生兒臍血中白細(xì)胞的全基因組DNA。

1.5.2 gap-PCR技術(shù)檢測3種常見缺失型α-地貧基因 采用gap-PCR技術(shù)檢測所有Hb Bart′s陽性樣本的3種常見缺失型α-地貧基因（—SEA、-α3.7、-α4.2）［3］。

1.5.3 HRM技術(shù)篩查α-基因的第三外顯子 從UCSC基因組數(shù)據(jù)庫（http：／／genome.ucsc.edu）獲得α-珠蛋白基因的DNA序列。用LightScanner Primer Design Software設(shè)計(jì)一對引物（正向引物：5′-CCGCACTGACCCTCTTCTCT-3′，反 向 引 物：5′-GCAACCGAGGCTCCAGC-3′）。挑出 gap-PCR技術(shù)未檢測出異常的Hb Bart′s陽性樣本DNA，同時選取2例基因型分別為αCSα／αα和αQSα／αα的陽性對照樣本及16例基因測序驗(yàn)證為第三外顯子無突變的陰性對照樣本DNA，利用96孔板，加入1×LC Greens Plus，擴(kuò)增α-基因（包含α1-和α2-基因）的第三外顯子，PCR擴(kuò)增片段長度為172 bp。PCR擴(kuò)增完成后，將96孔板移至LightScanner（Idaho Technology）進(jìn)行熔解曲線分析［4］。

1.5.4 用反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)檢測3種常見非缺失型α-地貧基因 對gap-PCR未檢出異常的樣本，用HRM技術(shù)篩查后，應(yīng)用反向點(diǎn)雜交 （RDB）技術(shù)檢測3種常見非缺失型α-地貧基因（Hb CS、Hb QS和 Hb WS）［5］。

1.5.5 直接測序法檢測檢測α1-和α2-基因全長從 UCSC數(shù)據(jù)庫（http：／／genome.ucsc.edu）中獲取α-珠蛋白基因（α1-和α2-基因）的 DNA 序列，應(yīng)用LightScanner Primer Design軟件設(shè)計(jì)2對引物，分別擴(kuò)增α1-和α2-珠蛋白基因（包含3個外顯子及部分上游和下游序列），引物序列詳見表1。對于未知基因型的Hb Bart′s陽性樣品，用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測α1-和α2-基因的全長。

1.5.6 統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 α-珠蛋白基因全長測序所用的引物

2 結(jié) 果

2.1 α-地貧基因的攜帶率 本研究共篩查1442例新生兒，經(jīng)基因分析，167例明確了α-地貧基因型（包括165例雜合子、2例雙重雜合子），即本研究中共檢出α-地貧等位基因169個，人群基因攜帶率為11.72%（169／1442）。

2.2 α-地貧等位基因的組成 169個α-地貧等位基因中東南亞缺失型（—SEA）112例，占總體的66.3%（112／169）；3種常見的缺失型（—SEA、-α3.7、-α4.2）占94.1%（159／169）；東南亞缺失型（—SEA）占3種常見缺失型的70.4%（112／159）；非缺失型α-地貧基因也有相當(dāng)?shù)谋戎兀é罜Sα、αQSα和 αWSα占5.9%），以αCSα、αQSα為主。

2.3 Hb Bart′s含量與α-地貧基因型的關(guān)系1442例新生兒臍血樣本中，2種電泳方法Hb Bart′s均為陽性的樣本151例（瓊脂糖凝膠電泳Hb Bart′s含量為0.5%～18.6%，毛細(xì)管電泳Hb Bart′s含量為0.1%～21.6%），基因確診150例。4例瓊脂糖凝膠電泳檢測 Hb Bart′s陽性（Hb Bart′s含量0.8%～2.57%），而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陰性的樣本，基因檢測未見異常。7例瓊脂糖凝膠電泳檢測Hb Bart′s陰性而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陽性的樣本（毛細(xì)管電泳Hb Bart′s含量0.1%～0.9%），基因檢測均為靜止型α-地貧。剩余1280例2種電泳Hb Bart′s均為陰性的樣本進(jìn)行2種常見靜止型α地貧基因（-α3.7、-α4.2）的分子篩查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。2種電泳方法篩查，臍血Hb Bart′s的含量均隨著α-基因缺陷（缺失或突變）的個數(shù)的增加而升高，Hb H病（3個α-基因缺陷）高于α0-地貧（2個α-基因缺陷）及α＋-地貧（1個α-基因缺陷），α0-地貧高于α＋-地貧。α＋-地貧中，不同基因型的 Hb Bart′s水平亦存在差異，αCSα／αα高于其它基因型。詳見表2。

表2 151例2種電泳方法Hb Bart′s均為陽性的樣本基因診斷結(jié)果

2.4 2種電泳方法的篩查特異性比較 151例2種電泳方法Hb Bart′s均為陽性的樣本，基因確診150例。4例瓊脂糖凝膠電泳檢測Hb Bart′s陽性而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陰性的樣本，基因檢測未見異常；7例瓊脂糖凝膠電泳檢測Hb Bart′s陰性而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陽性的樣本，基因檢測均為靜止型α-地貧，見表3。剩余1280例2種電泳Hb Bart′s均為陰性的樣本進(jìn)行2種常見靜止型α地貧基因（-α3.7、-α4.2）的分子篩查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα，見表4。

表3 11例僅一種電泳方法Hb Bart′s陽性的樣本基因診斷結(jié)果

表4 1280例2種電泳方法Hb Bart′s均為陰性的樣本基因診斷結(jié)果

2.5 HRM技術(shù)的敏感性及特異性 Hb Bart′s陽性，gap-PCR技術(shù)未檢出異常的樣本共15例，2例基因型分別為αCSα／αα和αQSα／αα的陽性對照及12例基因測序驗(yàn)證為第三外顯子無突變的陰性對照樣本，總共29例，全部擴(kuò)增成功，并獲得HRM熔解曲線（圖1）。29例樣本共形成4簇明曲線：7例與已知基因型為αCSα／αα樣本曲線集成一簇的待測樣本基因確診為αCSα／αα；3例與已知基因型為αQSα／αα樣本曲線集成一簇的待測樣本基因確診為αQSα／αα；單獨(dú)成一簇曲線與正常樣本分開的1例待測樣本基因確診為αWSα／αα；5例與正常樣本集成一簇的待測樣本，DNA測序第三外顯子未見突變。

圖1 HRM技術(shù)篩查α-基因第三外顯子的結(jié)果圖

3 討 論

人在不同發(fā)育時期血紅蛋白組成不同，正常胎兒和新生兒的血紅蛋白成分主要是 Hb F（α2γ2）；成人期血紅蛋白組成為：Hb A（α2β2）：96.5%～97.5%，Hb A2（α2δ2）：2.5% ～3.5%，Hb F（α2γ2）：0～1.0%。若α-珠蛋白鏈減少或缺乏會導(dǎo)致γ-珠蛋白鏈的相對增多，未與α-鏈結(jié)合的γ-鏈聚合成 Hb Bart′s（γ4）。因此，臍血中 Hb Bart′s與α-地貧直接相關(guān)。由于Hb Bart′s于出生3～6個月后即消失，理論上α-地貧的篩查最適合于新生兒期進(jìn)行，以降低漏檢率。本研究顯示，清遠(yuǎn)市戶籍人群總基因攜帶率達(dá)11.72%，高于廣東省的平均水平8.53%［6］。其中以缺失型α-地貧1基因（—SEA）為主（66.3%），突變型α-地貧基因也有相當(dāng)?shù)谋戎兀é罜Sα、αQSα和αWSα占5.9%）。

近年來，隨著全自動毛細(xì)管電泳技術(shù)的發(fā)展，克服了傳統(tǒng)電泳技術(shù)的缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳在操作方便性、操作時間、少試劑耗材、解析能力、檢測重復(fù)性及檢測成果清晰度均大大優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳，分離、定量 Hb Bart′s更加簡單、準(zhǔn)確［2］。本研究1442例樣本中，151例2種電泳方法Hb Bart′s均為陽性的樣本，基因確診150例。對于4例瓊脂糖凝膠電泳檢測Hb Bart′s陽性而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陰性的樣本，基因檢測未見異常。7例瓊脂糖凝膠電泳檢測Hb Bart′s陰性而毛細(xì)管電泳檢測Hb Bart′s陽性的樣本，基因檢測均為靜止型α-地貧。1280例兩種電泳Hb Bart′s均為陰性的樣本進(jìn)行2種常見靜止型α地貧基因（-α3.7、-α4.2）的分子篩查，查出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。可見，毛細(xì)管電泳分離定量Hb Bart′s的靈敏度及特異度均大于瓊脂糖凝膠電泳。因此，全自動毛細(xì)管電泳技術(shù)分離定量 Hb Bart′s具有簡便、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在α-地貧高發(fā)地區(qū)，該技術(shù)應(yīng)常規(guī)應(yīng)用于新生兒α-地貧篩查，以減少出生缺陷，提高人口素質(zhì)。

臍血Hb Bart′s的含量與α-基因缺陷（缺失或突變）的個數(shù)呈正相關(guān)。本研究顯示，毛細(xì)管電泳Hb Bart′s定量，α0-地貧的 Hb Bart′s的含量均大于1%，Hb H 病的 Hb Bart′s含量更高。而α＋-地貧中，除基因型為αCSα／αα的樣本 Hb Bart′s含量均大于1%以外，其他類型的α＋-地貧攜帶者Hb Bart′s含量均小于1%，其中-α3.7／αα攜帶者的 Hb Bart′s含量最低為0.1%。1280例2種電泳Hb Bart′s均為陰性的樣本檢出8例-α3.7／αα，2例-α4.2／αα。因此以臍血Hb Bart′s陽性為指標(biāo)，對新生兒進(jìn)行α-地貧篩查，能較準(zhǔn)確地篩查出Hb H病、α0地貧及αCSα／αα，但是，Hb Bart′s水平不宜作為αCSα以外的α＋-地貧的篩查指標(biāo)。然而隨著電泳技術(shù)的不斷發(fā)展，靜止型α-地貧的檢出率逐步提高。

本研究中，尚有1例毛細(xì)管電泳Hb Bart′s陽性的樣本未知基因型（Hb Bart′s含量為0.30%），可能的原因有：已有研究發(fā)現(xiàn)，中國人群中存在-α2..7缺失，累及α1-基因，本研究只檢測了-α3.7和-α4.2兩種缺失型α＋-地貧，有可能存在罕見的缺失型α＋-地貧未檢測到［7］；存在直接測序法檢測α1-和α2-基因全長無法檢測到的，影響α基因表達(dá)的上游突變；該峰為Z12區(qū)段非Hb Bart′s的異常血紅蛋白。

Munkongdee T等［1］對587例泰國新生兒臍血進(jìn)行毛細(xì)管電泳電泳Hb Bart′s定量篩查α-地貧，研究顯示：缺失1、2、3個α-基因的α-地貧攜帶者，其臍血Hb Bart′s含量分別為0.5%±0.2%、4.6%±0.5%、20.1%；該研究還顯示，正常人與α＋n-地貧攜帶者之間的Hb Bart′s含量相互重疊、不能區(qū)分，以Hb Bart′s含量0.2%為界，區(qū)分正常人與α＋-地貧攜帶者的效率最高。何曉玲等［8］，亦用毛細(xì)管電泳電泳技術(shù)定量Hb Bart′s的方法篩查中山市新生兒的α-地貧。本研究結(jié)果中Hb Bart′s的含量與基因缺陷個數(shù)的關(guān)系與Munkongdee T及何曉玲的研究相符，但是，本研究以Hb Bart′s含量0.1%為界，區(qū)分正常人與α-地貧攜帶者，Hb Bart′s陽性樣本151例，缺失型α＋-地貧只檢測了-α3.7和-α4.2兩種基因型，即有150例經(jīng)基因分析確診為α-地貧，另外1例Hb Bart′s陽性的樣品仍然可能存在未檢測到的α-基因缺陷。因此，我們認(rèn)為將新生兒臍血毛細(xì)管電泳Hb Bart′s含量0.1%作為區(qū)分正常人與α-地貧攜帶者的指標(biāo)更為理想。

與缺失型Hb H病相比，非缺失型Hb H病臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，更有αQSα／αQSα及—SEA／αQSα能引起水腫胎的報道［9，10］。因此篩查Hb CS和Hb QS有利遺傳咨詢指導(dǎo)婚姻，對優(yōu)生優(yōu)育具有十分重要的意義。本研究顯示，HRM技術(shù)篩查非缺失型α-地貧的敏感性和特異性亦均達(dá)100%，結(jié)果與陸林苑等［4］的研究相符。由于PCR擴(kuò)增和HRM分析整個過程用時不超過2小時，HRM分析法與普通PCR相比，只需在PCR反應(yīng)體系中多加1種DNA飽和熒光染料，每個樣本的試劑費(fèi)用不超過2元。因此，HRM技術(shù)可作為非缺失型α-地貧（尤其是αCSα和αQSα）的一種篩查方法，且具有準(zhǔn)確、高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)。

［1］Munkongdee T，Pichanun D，Butthep P，et al.Quantitative analysis of Hb Bart＇s in cord blood by capillary electrophoresis system［J］.Ann Hematol，2011，90（7）：741-746.

［2］Keren DF，Hedstrom D，Gulbranson R，et al.Comparison of Sebia Capillarys capillary electrophoresis with the Primus high-pressure liquid chromatography in the evaluation of hemoglobinopathies［J］.Am J Clin Pathol，2008，130（5）：824-831.

［3］李志玖，鄭芳，燕平，等.跨越斷裂位點(diǎn)PCR檢測α-地中海貧血基因缺失［J］.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，28（5）：451-452，456.

［4］陸林苑，唐海深，李東至.高分辨率熔解曲線分析技術(shù)在非缺失型α-地中海貧血新生兒篩查中的前瞻性應(yīng)用［J］.中國婦幼保健，2013，28（1）：156-159.

［5］郭廣洲，陳延娥，廖生赟，等.應(yīng)用反向點(diǎn)雜交法檢測α-地中海貧血點(diǎn)突變［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008（8）：785-787.

［6］Xu XM，Zhou YQ，Luo GX，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guangdong Province：implications for the future health burden and population screening［J］.J Clin Pathol，2004，57（5）：517-522.

［7］張俊武，龍桂芳.血紅蛋白與血紅蛋白病［M］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2003：212-215.

［8］何曉玲，張翠梅，馮華俊.中山市α-地中海貧血的新生兒篩查［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，32（4）：488-490.

［9］Liao C，Li J，Li DZ.Fetal anemia and hydrops associated with homozygosity for hemoglobin Quong Sze［J］.Prenat Diagn，2008，28（9）：862-864.

［10］Li DZ，Liao C，Li J，et al.Hemoglobin H hydrops fetalis syndrome resulting from the association of the—SEAdeletion and the alpha Quong Szealpha mutation in a Chinese woman［J］.Eur J Haematol，2005，75（3）：259-261.