劉 波，馬曉東，趙 宇，鄒 偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是指在圍產(chǎn)期窒息缺氧等因素導致的腦部缺氧缺血性損害，而此類疾病的治療至今仍為世界性醫(yī)學難題。本實驗采用7日齡新生大鼠制備HIBD模型，給予頭穴叢刺及豐富環(huán)境刺激干預，觀察其對新生大鼠缺氧缺血后突觸超微結(jié)構和EGFmRNA表達的的影響。為臨床頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激治療缺氧缺血性腦損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7日齡Wistar大鼠(由上海斯萊克公司提供)，雌雄不限，體重均在11～15 g之間。隨機分為造模組(A)、頭穴叢刺組(B)、豐富環(huán)境刺激組(C)、頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組(D)。每組11只(均選取3個時間點7 d、14 d、21 d 作為觀測點)。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD動物模型。7日齡新生Wistar大鼠，吸入適量無水乙醚麻醉，暴露頸部。局部碘伏消毒，做頸部正中切口，無菌分離左側(cè)頸總動脈，并用外科0號滅菌手術絲線行雙線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合傷口。手術結(jié)束后，將動物放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復120 min后，置于自制的有機玻璃缺氧箱中(保持37℃水浴恒溫)，持續(xù)將體積濃度為8%氧氣和92%氮氣的混合氣體以氣流量為0.5 L/min的速度輸入缺氧箱中。術后出現(xiàn)平衡異常、不能翻身或夾尾左旋者視為造模成功，將其納入實驗。

1.3 干預方法

造模組術后另置普通母鼠籠中飼養(yǎng)，不予任何治療。

頭穴叢刺組大鼠采用叢刺法，按照“大鼠穴位圖譜”［1］所示，取百會穴及百會左、右側(cè)各旁開1 mm處針刺。每穴快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h，每日1次。

豐富環(huán)境刺激組每日將幼鼠與母鼠分離放入EE籠［2］內(nèi)，給予EE干預2 h。播放舒緩的輕音樂，并以明暗紅色燈光照射。

頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組予以頭穴叢刺后再將幼鼠放入EE籠中給予環(huán)境刺激2 h，拔針放回母鼠籠中。

1.4 觀測指標

1.4.1 透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構 干預結(jié)束后，各組隨機抽取3只大鼠，快速斷頭取腦，剝離左側(cè)海馬CA1 區(qū)，組織塊大小約1.5 mm ×1.5 mm ×2 mm，每例取2個標本，放入2.5%戊二醛前固定24 h，先用PBS沖洗5 min×3次，再用1%鋨酸溶液固定2 h，并再次用PBS沖洗5 min×3次，梯度酒精脫水，用包埋液(苯二甲酸二丙烯酯)包埋，超薄切片做醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，而后用透射電子顯微鏡43 000倍觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構的變化。

1.4.2 原位雜交技術檢測EGFmRNA表達 具體方法參照原位雜交技術步驟［3］。

1.5 統(tǒng)計學分析

用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。組間差異進行方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 突觸超微結(jié)構變化

造模組(A)7 d海馬神經(jīng)細胞固縮改變，核膜皺折，染色體致密，雙核仁、胞漿致密，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張;14 d神經(jīng)元突觸數(shù)量減少，突觸間隙增寬，突觸囊泡減少，突觸后致密物變薄;21 d線粒體減少，腫脹呈球形，部分嵴斷裂或溶解消失，透明成空泡，突觸界膜融合，突觸小泡融合。14 d頭穴叢刺組(B)、豐富環(huán)境刺激組(C)、頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組(D)均神經(jīng)水腫嚴重，突觸融合，線粒體水腫較造模組減輕;21 d頭穴叢刺組(B)、豐富環(huán)境刺激組(C)突觸小泡多，致密物質(zhì)較豐富，突觸界限模糊。隨著治療時間的增加，21 d頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組(D)海馬神經(jīng)元核膜完整光滑，胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及高爾基體、線粒體等細胞器完整、豐富;核內(nèi)染色質(zhì)均勻，突觸結(jié)構好，突觸小泡數(shù)量較多。見圖1～8。

圖1 14天A組 圖2 21天A組 圖3 14天B組

圖4 21天B組 圖5 14天C組 圖6 21天C組

圖7 14天D組 圖8 21天D組

2.2EGFmRNA 表達

7 d各組EGF2mRNA陽性表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);14 d、21 d頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組(D)EGF2mRNA陽性表達最多，與造模組、頭穴叢刺組、豐富環(huán)境刺激組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

表1 EGF2mRNA陽性細胞表達結(jié)果(±s)

注:與造模組比較，aP＜0.01;與頭穴叢刺組比較，bP＜0.01;與豐富環(huán)境刺激組比較，cP＜0.01。

組別 n 7 d 14 d 21 d A 8 15.34 ±2.15 9.63 ±2.21 5.21 ±0.69 B 8 16.46 ±2.23 12.53 ±2.86a 10.16 ±2.36a C 8 15.27 ±2.12 11.43 ±3.37a 9.21 ±2.13a D 8 16.87 ±3.25 15.58 ±4.35abc 13.45 ±3.57abc

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)元之間以錯綜復雜的突起及突觸相聯(lián)系形成的神經(jīng)網(wǎng)絡。神經(jīng)元又稱為神經(jīng)細胞，是構成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構和功能的基本單位，是大腦學習記憶的結(jié)構基礎。而突觸是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。突觸是由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜三部分構成。通常情況下，突觸多處于休眠狀態(tài)，在外界條件的刺激下，突觸可被激活，使損傷造成的功能障礙得到恢復［4］。

李文霞等制備HIBD新生大鼠模型，采用電刺激小腦頂核，觀察其對神經(jīng)元超微結(jié)構的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧缺血組線粒體腫脹，有的空泡化，神經(jīng)元細胞水腫，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，突觸間隙融合消失等結(jié)構改變;而電刺激組線粒體數(shù)量增加，細胞器豐富，突觸間隙清晰，突觸小泡增加。說明電刺激可減輕腦缺血神經(jīng)元及突觸的病理損傷，促進HIBD腦組織超微結(jié)構的恢復［5］。而于若谷等發(fā)現(xiàn)，早期給予撫觸及豐富環(huán)境刺激干預，可以促進缺血缺氧的腦組織超微結(jié)構恢復［6］。本研究觀察頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激能夠明顯促進缺氧缺血腦損傷后突觸超微結(jié)構的恢復，優(yōu)于單純頭穴叢刺和豐富環(huán)境刺激。

表皮生長因子(EGF)作為一種促神經(jīng)生長因子，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和細胞的生長、增殖及分化［7］，可促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。楊卓欣等［8］電針任脈承漿、氣海、關元三穴，觀察對缺血再灌注大鼠腦內(nèi)生長因子的表達影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFmRNA、NGFmRNA、bFGFmRNA的陽性表達均隨著再灌注時間的延長，呈現(xiàn)減弱的趨勢，而電針任脈經(jīng)穴能夠明顯延遲這一趨勢的發(fā)展，并促進MCAO大鼠腦內(nèi)EGFmRNA等的表達，從而達到抗缺血損傷、神經(jīng)修復的作用。本實驗結(jié)果顯示，14 d、21 d頭穴叢刺、豐富環(huán)境刺激均可促進EGFmRNA表達，與造模組比較有顯著性差異，而頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激的EGFmRNA陽性表達明顯多于單純頭穴叢刺和豐富環(huán)境刺激組。

綜上所述，頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境能夠明顯促進缺氧缺血腦損傷后突觸超微結(jié)構的恢復和增加EGFmRNA的表達，這為臨床應用頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激治療缺氧缺血性腦損傷提供了實驗依據(jù)。

［1］華興邦.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實驗動物與動物實驗，1991(1):1－5

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［5］李文霞，曹娟，代紅，等.電刺激小腦頂核對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2009，24(2):140－142

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［8］楊卓欣，馬曉明，于海波，等.缺血再灌注大鼠腦內(nèi)生長因子的表達及電針任脈的干預作用［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2009，27(6):1152－1155