李 松 吳光斌 陳發(fā)河

（集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）

福建省是中國(guó)優(yōu)質(zhì)柚類(lèi)的主要產(chǎn)區(qū)，主栽品種有琯溪蜜柚、文旦柚等，其柚類(lèi)產(chǎn)量已超過(guò)全國(guó)柚類(lèi)總產(chǎn)量的1／3。僅平和縣就種植琯溪蜜柚4.3萬(wàn)hm2以上，年產(chǎn)已達(dá)80萬(wàn)t。柚類(lèi)的果皮率高達(dá)40%［1］，精油約占果皮鮮重的0.5%～2.0%［2］，主要存在于外果皮的油胞層中。柚類(lèi)果皮精油（essential oil）屬于植物精油，它是一類(lèi)植物源次生代謝物質(zhì)，具有一定揮發(fā)性的油狀液體物質(zhì)。精油主要由萜烯烴類(lèi)物質(zhì)及其含氧衍生物組成，主要的萜烯類(lèi)化合物是檸檬烯約占32%～98%，含氧化合物含量往往低于5%，而后者卻是精油香味的主要來(lái)源。由于柚類(lèi)精油具有獨(dú)特優(yōu)雅的芳香，廣泛用于食品工業(yè)［3－5］（如清涼飲料、果醬、糕點(diǎn)、糖果、餅干、冰淇淋等）和日化工業(yè)［6－8］（如香水、化妝品、牙膏香精、浴用劑、家用清潔劑等），精油中的單體成分具有很高的應(yīng)用價(jià)值，如檸檬烯、月桂烯、芳樟醇、蛇床子素、香豆素［9－11］等?，g溪蜜柚果皮提取的精油具有獨(dú)特的芳香，研究［12］表明，琯溪蜜柚果皮揮發(fā)性物質(zhì)含量較高。

目前柚類(lèi)精油主要采取水蒸餾、溶劑萃取、壓榨等方法提取。但這幾種方法各有不足。蒸餾法由于加熱時(shí)間較長(zhǎng)，精油中有些成分會(huì)發(fā)生水解或降解，還會(huì)導(dǎo)致精油帶有蒸煮味；溶劑萃取法由于需要大量處理溶劑而難免引入雜質(zhì)，這對(duì)植物成分的分析很不利；壓榨法由于原料的吸附精油得率較低。超臨界CO2萃取法具有萃取率高、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)研究超臨界CO2萃取琯溪蜜柚精油的工藝技術(shù)，并對(duì)萃取精油的組分進(jìn)行分析，以期為琯溪蜜柚果實(shí)綜合加工利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

琯溪蜜柚：采自福建省平和縣果園；

無(wú)水硫酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

二氧化碳：純度99.999%，林德氣體（廈門(mén)）有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：PL602－S型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

超臨界萃取裝置：HA221－50－06型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent7890A－5975C型，美國(guó)安捷倫（Agilent）科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 琯溪蜜柚果皮干粉制備 蜜柚果皮分黃色皮層（外果皮）和白色皮層（外果皮），經(jīng)測(cè)定黃色皮層僅占蜜柚果皮重量的（21.59±3.37）%。蜜柚果皮精油主要存在于果皮的黃色皮層的油胞中，白色皮層幾乎不含精油，去除白色皮層能有效提高投料效率和減少白色皮層對(duì)精油的吸附效應(yīng)。預(yù)試驗(yàn)表明，去除白皮層后，同樣的投料量精油得率提高5倍以上。因此，本試驗(yàn)選用琯溪蜜柚果皮的黃色皮層為材料，將黃色皮層陰干，粉碎備用。

1.2.2 精油制取工藝 稱(chēng)取一定量的琯溪蜜柚果皮干粉，添進(jìn)料桶后，裝入萃取釜封緊后，排出殘余空氣，調(diào)節(jié)萃取溫度和壓力，分離壓力7MPa，分離溫度32℃連續(xù)萃取90min后，從分離釜出口接收精油產(chǎn)物，準(zhǔn)確稱(chēng)其質(zhì)量，計(jì)算得率。

產(chǎn)物得率計(jì)算公式如下：

式中：

R—— 產(chǎn)物提取率，%；

m1—— 產(chǎn)物質(zhì)量，g；

m2—— 蜜柚果皮干粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)按下列處理進(jìn)行：① 萃取壓力對(duì)產(chǎn)物得率的影響，選取萃取溫度40℃，萃取時(shí)間90min，萃取壓力分別取10，15，20，25，30MPa；② 萃取溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響，選取萃取壓力25MPa，萃取時(shí)間90min，萃取溫度分別取35，40，45，50，55℃；③ 萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率的影響，選取萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，萃取時(shí)間分別取30，50，70，90，110min。每次投料80.00g，試驗(yàn)重復(fù)3次。確定各因素的最佳范圍。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，采用三因素三水平的Box－Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)以時(shí)間、壓力、溫度的值為自變量，以產(chǎn)物得率為因變量，研究響應(yīng)值以及最佳變量的組合。

1.2.5 精油組分的氣相色譜－質(zhì)譜檢測(cè) 最優(yōu)條件下的精油，無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾除雜作樣品，進(jìn)行氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測(cè)。

（1）色譜條件：色譜柱：HP－5MS，30m×0.25mm×0.25μm石英毛細(xì)管柱；程序升溫：初溫80℃，保持10min，3℃／min升至250℃，保持5min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比100∶1，進(jìn)樣量0.2μL；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：氦氣（純度為99.999%），流速1.0mL／min。

（2）質(zhì)譜條件：離子源：EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；接口溫度280℃；電子能量70eV；溶劑延遲2min；質(zhì)量掃描范圍：22～500amu；掃描范圍 （m／z）30～350amu；采集方式全掃描scan；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù) NIST98和Wiley7n.1標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 萃取壓力對(duì)產(chǎn)物得率的影響 萃取壓力對(duì)產(chǎn)物得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)壓力低于25MPa時(shí)，隨著壓力的上升，產(chǎn)物得率不斷提高，但是超過(guò)25MPa以后，產(chǎn)物得率呈下降態(tài)勢(shì)。

圖1 萃取壓力對(duì)提取率的影響Figure 1 Influence of extraction pressure on yield

壓力變化會(huì)對(duì)萃取率產(chǎn)生影響，也會(huì)對(duì)萃取的選擇性產(chǎn)生影響。當(dāng)壓力處于較低水平（小于25MPa）時(shí)，壓力增加一方面使CO2流體的密度增大，溶質(zhì)的溶解度隨之上升，另一方面減少了分子間的傳質(zhì)距離，使傳質(zhì)速率較理想，有利于萃取過(guò)程的進(jìn)行；由于CO2對(duì)精油的溶解度與壓力不成線(xiàn)性關(guān)系，當(dāng)壓力較高（大于25MPa）時(shí)，繼續(xù)增加萃取壓力，雖CO2流體密度和其對(duì)溶質(zhì)的溶解度有較小的上升，但是CO2流體黏度增大，流動(dòng)性降低，傳質(zhì)性受到嚴(yán)重影響，從而造成產(chǎn)物得率降低；并且過(guò)高壓力對(duì)設(shè)備要求高，投入成本較大，也會(huì)造成CO2流體選擇性下降，導(dǎo)致產(chǎn)物雜質(zhì)增多，流動(dòng)性降低不但影響產(chǎn)物的收集也影響產(chǎn)物的品質(zhì)。

綜上所述，無(wú)論從產(chǎn)物提取率和品質(zhì)，還是從設(shè)備投入角度考慮，萃取壓力都不宜過(guò)高，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定萃取壓力為25MPa比較合適。

2.1.2 萃取溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響 萃取溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，在30～40℃時(shí)，產(chǎn)物得率隨溫度升高而增加；當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，產(chǎn)物得率反而處于較低的水平。

出現(xiàn)這樣的情況是因?yàn)檩腿囟葘?duì)產(chǎn)物得率的影響是兩方面制衡的結(jié)果：① 萃取溫度的升高會(huì)引起CO2流體密度下降，使得對(duì)產(chǎn)物的溶解度降低；② 溫度升高，CO2擴(kuò)散系數(shù)增加，提高CO2萃取能力，同時(shí)加大了精油在CO2流體中的飽和蒸汽壓，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，促進(jìn)物料分子擴(kuò)散，利于萃取。當(dāng)處于30～40℃范圍內(nèi)，升溫對(duì)CO2擴(kuò)散系數(shù)增加和精油飽和蒸汽壓及擴(kuò)散作用強(qiáng)于CO2流體密度下降帶來(lái)的不利影響，所以產(chǎn)物提取率隨溫度上升而增加；但是當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，CO2流體密度下降的不利影響占據(jù)主導(dǎo)地位，所以產(chǎn)物得率會(huì)較低；50℃以后會(huì)有小幅上升，可能是因?yàn)闇囟壬仙龑?duì)精油溶解度增加幅度更大。

圖2 萃取溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響Figure 2 Influence of extraction temperature on yield

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率的影響 萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，70min以前，產(chǎn)物萃取率隨萃取時(shí)間增加幾乎呈直線(xiàn)上升；70～90min，增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩，但產(chǎn)物得率仍有較大的提高；90min以后曲線(xiàn)趨于平緩，幾乎沒(méi)有變化。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率的影響Figure 3 Influence of extraction time on yielde

CO2流體對(duì)精油的萃取過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程。萃取開(kāi)始階段，精油成分主要分布在顆粒表面，內(nèi)擴(kuò)散阻力較小，因此產(chǎn)物得率比較高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)物得率直線(xiàn)上升；隨著萃取的進(jìn)行，內(nèi)擴(kuò)散阻力逐漸增大，精油含量逐漸降低，CO2溶出的精油量逐漸減小，萃取效率趨向于零，萃取過(guò)程進(jìn)入完結(jié)階段，所以曲線(xiàn)趨于平緩，產(chǎn)物得率幾乎沒(méi)有變化。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平，見(jiàn)表1。

響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果見(jiàn)表2，采用Design－Experts程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到擬合方程為

由表3可知，壓力、溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率均具有顯著影響，在選取的因素范圍內(nèi)，各因素對(duì)產(chǎn)物得率影響排序?yàn)閄2＞X3＞X1，即壓力 ＞ 溫度 ＞ 時(shí)間。F＝260.87，P＜0.000 1表明該模型極顯著；F 失擬 ＝0.64，失擬項(xiàng)P＝0.702 0＞0.05表明該模型失擬不顯著。Box－Behnken法計(jì)算產(chǎn)物得率回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)r2＝0.996 2，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)超臨界CO2萃取館溪蜜柚精油進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in the Box－Behnken experimental design

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)和產(chǎn)物得率Table 2 Box－Behnken experimental design matrix and corresponding experimental results of the yield

由圖4可知，在萃取時(shí)間為90min條件下，萃取壓力和萃取溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響存在交互作用。在低溫條件下，產(chǎn)物得率隨著溫度的升高而增加，這可能與溫度升高導(dǎo)致物質(zhì)傳輸速度的增加有關(guān)。但是，當(dāng)溫度升高到一定值后，隨著溫度的升高，產(chǎn)物得率反而開(kāi)始下降，其原因可能與CO2濃度的降低有關(guān)。在低壓條件下，壓力與產(chǎn)物得率正相關(guān)，隨著壓力升高，CO2濃度也隨之升高，從而增加了精油的溶解度。在高壓條件下，隨著萃取壓力升高到15MPa時(shí)，產(chǎn)物得率會(huì)達(dá)到一個(gè)最大值，隨后壓力的升高對(duì)產(chǎn)物得率就不再有明顯的影響。

采用響應(yīng)面優(yōu)化琯溪蜜柚精油提取工藝，確定最終優(yōu)化工藝為萃取時(shí)間92.40min，萃取壓力18.26MPa，萃取溫度38.22℃，此條件下產(chǎn)物得率為10.28%。

為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，同時(shí)考慮設(shè)備控制因素，修正后的最優(yōu)條件為萃取時(shí)間93min，萃取壓力18MPa，萃取溫度38℃，在該條件下進(jìn)行6組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際產(chǎn)物得率為10.22%±0.04%，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果可靠，工藝參數(shù)可行。

表3 回歸模型方差分析和模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of varlances for the developed response surface quadrtic model

圖4 壓力和溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 4 Three－dimensional response surface graphs and the contour plots showing the pairwise interactive effects between extraction pressure and extraction temperature on essential oil yield

2.3 精油組分分析結(jié)果

將在優(yōu)化的最佳條件下獲得的精油樣品進(jìn)行組分分析，GC／MS檢測(cè)的總離子流（TIC）圖見(jiàn)圖5。圖譜經(jīng)NIST08.L譜圖庫(kù)自動(dòng)檢索，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、人工解析并查對(duì)文獻(xiàn)等方法確認(rèn)各化合物，并采用面積歸一化法確定各組分的相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖5 超臨界萃取精油總粒子流圖Figure 5 Total ion current chromatogram of the essential oil from Guanxi honey pomelo by SFE

表4 超臨界萃取產(chǎn)品組分及相對(duì)含量Table 4 Component analysis of essential oil from Guanxi honey pomelo by SFE

續(xù)表4

超臨界萃取產(chǎn)品總共鑒定出52種成分，占出峰物質(zhì)總量的96.36%。其中烴類(lèi)物質(zhì)26種高達(dá)95.14%，如月桂烯（29.83%）和 D－檸 檬 烯 （61.92%）等；含 氧 化 合 物 僅 占1.22%，如芳樟醇（0.30%）、順式檸檬醛（0.24%）、反式檸檬醛（0.33%）等。精油含氧化合物雖然含量較少，但卻是柚皮精油香氣的主要貢獻(xiàn)者，已被證實(shí)的柚子特征香氣成分圓柚酮［13］在本試驗(yàn)中也有檢出。

試驗(yàn)結(jié)果表明，琯溪蜜柚果皮精油中主要為D－檸檬烯和月桂烯，分別達(dá)到61.92%和29.83%，而芳樟醇和圓柚酮含量相對(duì)較低。夏湘等［14］研究發(fā)現(xiàn)δ－欖香烯、石竹烯、橙花醇、香葉醇等成分的提取率與提取條件具有顯著的相關(guān)性。萃取溫度和壓力的變化明顯影響精油不同成分的得率，升高溫度降低壓力利于萃取選擇性的提高［15］。

雖然高含量的烯烴類(lèi)物質(zhì)，如D－檸檬烯和月桂烯，對(duì)柚子香氣貢獻(xiàn)很小，但卻應(yīng)用廣泛。例如，月桂烯可以鎮(zhèn)咳，也可以作為精細(xì)化工合成中間體；D－檸檬烯可用于制備合成樹(shù)脂和合成橡膠，調(diào)配橙花香精、柑桔油等，也可用于制作檸檬系精油的代用品，許多日化香精配方中，其用量可達(dá)30%［16］；以檸檬烯為原料還可以合成多種香料［17］，制備環(huán)保油墨清洗劑［18］；同時(shí)D－檸檬烯具有抗菌、抗氧化、祛痰平喘、利膽溶石、抗癌抗腫瘤等功效［19－21］。

3 結(jié)論

（1）超臨界CO2萃取琯溪蜜柚精油最佳工藝條件為萃取時(shí) 間 92.40min，萃 取 壓 力 18.26MPa，萃 取 溫 度38.22℃，此條件下產(chǎn)物得率為10.28%。

（2）對(duì)在優(yōu)化的最佳條件下獲得的精油樣品進(jìn)行組分分析，結(jié)果表明超臨界CO2萃取精油產(chǎn)品總共鑒定出52種成分，占出峰物質(zhì)總量的96.36%。其中烴類(lèi)物質(zhì)26種高達(dá)95.14%，含氧化合物僅占1.22%。

（3）與筆者［22］先期研究的利用同時(shí)蒸餾萃取方法和有機(jī)溶劑萃取方法萃取琯溪蜜柚精油相比，超臨界CO2萃取具有萃取時(shí)間短、選擇性好、萃取率高、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。

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