王 超 汪江英 時(shí) 磊 黃師榮

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

油脂和含油脂食品易于發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)的下降，甚至變質(zhì)［1］。另一方面，很多心血管疾病以及衰老的發(fā)生和發(fā)展也與氧化反應(yīng)有關(guān)［2］。因此開發(fā)和利用抗氧化活性的物質(zhì)對(duì)食品和人體均具有相當(dāng)重要的作用?？寡趸瘎┛梢酝ㄟ^抑制氧化鏈反應(yīng)的引發(fā)或傳遞來延緩或抑制脂類或其他分子氧化，阻止或修復(fù)氧化對(duì)身體細(xì)胞的損傷。近年來，合成抗氧化劑如BHA、BHT、TBHQ等由于其毒性而受到質(zhì)疑。大量研究［3－5］表明，植物中的許多物質(zhì)，尤其是多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以抑制自由基反應(yīng)的傳遞、防止人體生病、延緩脂類氧化酸敗。因而從植物材料中尋找天然抗氧化物質(zhì)越來越受到人們的歡迎，對(duì)植物提取物有效成分抗氧化活性的研究和開發(fā)日益受到重視。

梅干萊亦稱梅菜，是把三月青、九頭芥、雪里蕻等鮮菜堆黃后腌制再干燥而制得的［6］。梅干菜是一種極耐貯存的菜，在室內(nèi)常溫下，2～3年都不會(huì)變質(zhì)。在中國(guó)民間梅干菜經(jīng)常被用于蒸肉，據(jù)報(bào)道［7］，梅干菜蒸肉比不加梅干菜的蒸肉能保存更久，其保質(zhì)期可達(dá)6個(gè)月之久。梅干菜這一性能可能要部分歸因于其潛在的抗氧化性。

王萍等［8］報(bào)道了葉用芥菜具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Fang等［9］研究了腌制方法對(duì)雪里蕻中總游離酚酸含量、總酚酸含量、總酚含量和抗氧化活性的影響。他們發(fā)現(xiàn)，在腌制過程中總游離酚酸含量增加，腌制是保持雪里蕻酚酸和抗氧化物質(zhì)的較好方法，雪里蕻腌菜是抗氧化物質(zhì)的良好來源。但是，關(guān)于九頭芥梅干菜的抗氧化性研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以酚類化合物含量及抗氧化活性為指標(biāo)，研究九頭芥梅干菜中酚類化合物的提取、富集及其抗氧化活性，旨在為九頭芥梅干菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九頭芥梅干菜：購(gòu)于江西廣昌農(nóng)村市場(chǎng)，是用九頭芥鮮菜進(jìn)行堆黃后腌制，再在日光下暴曬至菜梗曬干而得；

DPPH：日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；

福林酚、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素：合肥博美生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；

其余試劑：均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：2802SW型，龍尼柯（上海）儀器有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：BSA2245型，賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R－201型，上海申生科技有限公司；

液相色譜儀：Waters 1525型，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 九頭芥梅干菜乙醇提取物的制備 稱取經(jīng)干燥粉碎的九頭芥梅干菜粉末20g，按料液比1∶5（m∶V）加入無水乙醇，60℃恒溫水浴振蕩浸提4h，抽濾，濾渣按上述條件重復(fù)提取1次，抽濾后合并兩次濾液并于40℃下減壓旋蒸至干，得到3.466g褐色的梅干菜乙醇提取物。

1.3.2 九頭芥梅干菜乙醇提取物的分級(jí)萃取 按文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行。稱取10g九頭芥梅干菜乙醇提取物，加入100mL蒸餾水，并用超聲輔助分散，所得懸浮液依次采用石油醚、乙酸乙酯各100mL分別萃取3次，得到石油醚、乙酸乙酯萃取液和萃余液。各萃取液和萃余液分別在40℃減壓旋蒸至干，得到石油醚相1.712g，乙酸乙酯相2.289g，萃余相5.413g。

1.3.3 總酚含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)［11］，并加以改進(jìn)。把九頭芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃余物用無水乙醇配成質(zhì)量濃度為2mg／mL的溶液。取1mL測(cè)試液加入25mL容量瓶中，接著加入2.5mL用蒸餾水稀釋了10倍的福林酚試劑和2mL質(zhì)量濃度為75g／L的Na2CO3，再加蒸餾水定容至刻度，混合均勻后把試管置于50℃的水浴中保溫5min，取出并冷卻，所得溶液于760nm處測(cè)吸光度。以無水乙醇做空白對(duì)照。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成0.02，0.03，0.04，0.05，0.06mg／mL標(biāo)準(zhǔn)液，按以上方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的總酚以相當(dāng)于沒食子酸的含量表示，單位以每g提取物含有沒食子酸的當(dāng)量mg數(shù)表示（mg GAE／g）。

1.3.4 DPPH自由基清除活性測(cè)定 按文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行。取不同質(zhì)量濃度的各個(gè)組分乙醇溶液3mL，與3mL濃度為200μM的DPPH乙醇溶液混合，使其終濃度為100μM，振蕩搖勻，置于暗處反應(yīng)30min后于517nm處測(cè)吸光度。每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，取平均值。同時(shí)以BHT作為陽性對(duì)照。用下式計(jì)算DPPH自由基的清除率：

式中：

S——DPPH自由基的清除率，%；

A0——空白樣品的吸光度；

As0——測(cè)試樣品的本底吸光度；

As——測(cè)試樣品的吸光度。

1.3.5 還原力測(cè)定 按文獻(xiàn)［13］報(bào)道的方法進(jìn)行。取1mL不同質(zhì)量濃度的各個(gè)組分的乙醇溶液，加入2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.1M，pH 6.6）和2.5mL 鐵 氰化鉀 （1%，m／V）?；旌衔镉?0℃下保溫20min，然后加入2.5mL，10%的三氯乙酸，激烈振搖后，3 000r／min離心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL三氯化鐵溶液（0.1%，m／V）。 搖勻，靜置30min后，于700nm處測(cè)吸光度，空白組以無水乙醇代替樣液。吸光度增加表明還原力增加。同時(shí)用BHT做陽性對(duì)照。

1.3.6 高效液相色譜分析 各樣品用色譜級(jí)無水甲醇配成5mg／mL的樣液，標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.1mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品樣液，各樣品在進(jìn)樣前用孔徑為0.45μm的膜過濾器進(jìn)行了過濾。所用的色譜柱為Symmetry?C18 5μm 4.6×250nm柱。色譜條件［9］：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為4%的乙酸，采用等度洗脫A∶B＝20∶80（V∶V），流速為1mL／min，洗脫時(shí)間為35min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。通過比較各樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)一些峰進(jìn)行了鑒定。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）以Duncans檢驗(yàn)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量

酚類化合物是苯環(huán)上帶有羥基官能團(tuán)的一類物質(zhì)。許多研究［14，15］表明，酚類化合物對(duì)天然植物提取物的抗氧化活性有重要貢獻(xiàn)。因此，測(cè)定提取物中的總酚含量顯得十分的重要。在本研究中用Folin－Ciocalteu比色法測(cè)定了九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分中的總酚含量。

圖1 九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分的總酚含量Figure 1 Total phenolic contents of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

本試驗(yàn)以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到的回歸方程為y＝6.493 3x＋0.048 3，相關(guān)系數(shù)R2＝0.996 7。 試驗(yàn)結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量／提取物（mg GAE／g）。由試驗(yàn)測(cè)得各樣品的總酚含量見圖1。由圖1可知，各萃取相中總酚含量差異顯著，乙酸乙酯相中總酚含量為17.57mg GAE／g，分別是乙醇提取物、石油醚相和萃余相的3.2倍、2.8倍和3.8倍，各樣品中總酚含量大小依次是乙酸乙酯相＞石油醚相＞乙醇提取物＞萃余相。結(jié)果表明，主要的酚類物質(zhì)經(jīng)過萃取都溶入了中等極性的乙酸乙酯中，根據(jù)極性相似相容原理可知九頭芥梅干菜含有的酚類物質(zhì)以中等極性的酚類化合物為主。

2.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈現(xiàn)深紫色，在517nm處有最大吸收。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，其一個(gè)N原子上的孤電子對(duì)被配對(duì)，溶液的吸光度會(huì)減弱或消失。通過DPPH溶液吸光度的改變來評(píng)價(jià)清除自由基的能力大小，吸光度減少得越多表明其清除能力越強(qiáng)。

圖2給出了九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分對(duì)DPPH自由基的清除活性。由圖2可知，各樣品對(duì)DPPH自由基都有很好的清除率，隨著濃度的增加對(duì)自由基的清除率顯著增加。乙酸乙酯相在濃度為2mg／mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)96.10%。通過origin程序擬合計(jì)算得出BHT、乙醇提取物、石油醚相、乙酸乙酯相和萃余相對(duì)DPPH自由基清除活性的EC50（清除活性為50%時(shí)的樣品濃度）分別為0.07，2.20，3.06，0.65，3.92mg／mL。各試樣對(duì)DPPH自由基清除力的大小依次為BHT＞乙酸乙酯相＞乙醇提取物＞石油醚相＞萃余相。在九頭芥梅干菜乙醇提取物的各溶劑萃取組分中，乙酸乙酯相清除活性最強(qiáng)，表明在九頭芥梅干菜中對(duì)DPPH自由基清除活性最強(qiáng)的化合物為中等極性物質(zhì)。許多研究得到了相似的結(jié)果［16－20］。

比較各樣品對(duì)DPPH自由基清除率的大小順序與其總酚含量的大小順序，發(fā)現(xiàn)它們之間的關(guān)系并不一致，這可能與不同樣品中有效酚酸的種類和含量不同有關(guān)，進(jìn)而對(duì)DPPH自由基清除能力不同，也有可能與其含有的非酚類化合物相關(guān)。

圖2 梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分對(duì)DPPH自由基的清除活性Figure 2 DPPH radical－scavenging activities of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

2.3 還原力

還原能力是物質(zhì)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)，也是物質(zhì)抗氧化機(jī)理之一。許多研究［18，20，21］表明，植物提取物的抗氧化活性與其還原力存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。還原力測(cè)定原理是基于Fe3＋被抗氧化物質(zhì)還原為Fe2＋而呈現(xiàn)綠色，并于700nm處有最大吸收。根據(jù)吸光度的大小來判斷試樣抗氧化活性的強(qiáng)弱。反應(yīng)體系的吸光度增加意味著還原力增加。

圖3給出了九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分和BHT的還原力。由圖3可知，所有樣品的還原力均隨著濃度的增加而增加，所有濃度下各樣品均顯示出一定程度的還原能力。在濃度為5mg／mL時(shí)，九頭芥梅干菜乙醇提取物、乙酸乙酯相、石油醚相和萃余相的吸光度分別為0.314，0.764，0.648，0.288。各樣品的還原力大小順序?yàn)?BHT＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞乙醇提取物＞萃余相。許多文獻(xiàn)均得到相似的結(jié)果［17－20，22］，即乙酸乙酯組分的還原力明顯強(qiáng)于其余組分，表明乙酸乙酯組分更易供出電子還原Fe3＋。

許 多研究［14，15，22，23］表 明 酚 類 化 合 物 的 含 量 與 抗 氧 化 性密切相關(guān)：酚類含量越高其抗氧化性越強(qiáng)。由各樣品的還原力大小順序可以看出，其與各樣品總酚含量的大小順序相一致，說明酚類化合物對(duì)各樣品的還原力貢獻(xiàn)較大。

圖3 梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分的還原力Figure 3 Reducing power of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

2.4 高效液相色譜分析

九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分的HPLC分析表明其中存在酚類化合物。由圖4可知，各樣品的HPLC峰數(shù)量、保留時(shí)間、響應(yīng)值存在一定差異。乙酸乙酯相的峰數(shù)量最多，石油醚相的峰數(shù)量最少，萃余相的峰響應(yīng)值很高，而石油醚相的峰響應(yīng)值很低，說明各樣品中抗氧化物質(zhì)的組成和含量不同。在所用的幾種標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的基礎(chǔ)上鑒定了一些峰，發(fā)現(xiàn)九頭芥梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分中均含有沒食子酸，而且為主要成分，其峰面積大小順序?yàn)檩陀嘞啵疽掖继崛∥铮疽宜嵋阴ハ啵臼兔严唷?/p>

圖4 梅干菜乙醇提取物及其各溶劑萃取組分的高效液相色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of ethanolic extract from pickled and dried mustard and its various fractions

3 結(jié)論

九頭芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚和乙酸乙酯萃取組分均具有一定的抗氧化性，它們的總酚含量、抗氧化活性差異顯著，其中乙酸乙酯萃取的組分抗氧化活性最強(qiáng)，總酚含量也最高；表明可以用乙酸乙酯來富集九頭芥梅干菜中的抗氧化成分。高效液相色譜分析表明九頭芥梅干菜乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯萃取物和萃余相中主要的酚類化合物為沒食子酸。試驗(yàn)結(jié)果表明九頭芥梅干菜提取物可以作為天然抗氧化劑的潛在來源。

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