王麗麗 楊憲時 李學英 遲 海

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.大連海洋大學食品學院，遼寧 大連 116023）

魷魚又名柔魚、槍烏賊，軟體動物類，是目前世界上最具開發(fā)潛力的大洋海產品之一［1］。魷魚不僅捕獲量大，而且營養(yǎng)豐富，含有15%～19%的蛋白質，11%～15%的脂肪，及鈣、磷、硒、錳、銅等礦物質［2］。魷魚可食部分達80%以上，是可利用率較高的肉類資源。近年受全球經濟下滑的影響，國際魷魚市場疲軟，魷魚鮮銷量直線下跌，而魷魚加工產業(yè)卻快速發(fā)展起來［3］。但是一直以來魷魚的加工利用基本停留在其胴體上，足、耳、內臟等一些加工副產物則作為低價副產品被加工成飼料或扔掉［4］。其中魷魚足表皮層厚，顏色深黑且吸盤不易去除，其去皮問題一直是魷魚加工企業(yè)較難解決的問題。有學者［5］通過單因素試驗或者單因素結合正交試驗研究過魷魚胴體酶法去皮工藝，雖然去皮效果理想，但是由于魷魚足質地、結構的特殊性，其工藝不適合應用在魷魚足去皮環(huán)節(jié)上。目前企業(yè)多采用木瓜蛋白酶酶解和人工結合的方法去除足表皮，但是這種方法消耗大量人力財力，效率極低。目前純粹用酶水解魷魚足去皮工藝的研究尚未見報道。

魷魚足去皮效果最直接有效的評價指標即產品色澤，白而有光澤為最好。Lab顏色空間是當前最常用的測定物體顏色的色空間之一［6］。該色空間由直角坐標L＊、a＊、b＊構成，其中L＊軸表示顏色明度，L＊＝0表示黑色，L＊＝100表示白色，即L＊值越高說明樣品越白［7］。 但在實際生產中，不能只考慮色澤指標，還要兼顧肌肉組織質構和得率變化。本試驗通過對比中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、動物蛋白水解酶對魷魚足酶解去皮的效果，選擇去皮效果較好且宜于工業(yè)化生產的酶種，以L＊值結合感官評分為雙重指標，采用單因素考察和響應面分析優(yōu)化魷魚足去皮工藝，以達到充分利用魷魚資源，提高魷魚加工企業(yè)經濟效益的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

秘魯魷魚足：舟山市越洋食品有限公司；

動物蛋白水解酶（實測酶活力157 873U／g），中性蛋白酶（實測酶活力173 418U／g），木瓜蛋白酶（實測酶活力743 365U／g），堿性蛋白酶（實測酶活力187 417U／g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；

硫酸銅、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

數顯恒溫水浴鍋：HH－6型，常州國華電器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：5－2型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

電子天平：FA1004A型，上海精天電子儀器有限公司；

pH值／溫度測量儀：Testo 230型，德圖儀器上海有限公司；

色差儀：Chroma Meter CR－400型，日本美能達公司；

質構儀：TMS－Pro型，美國 Food Technology Corporation公司；

便攜式色差儀：S560型，美國MicroOptix公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 將魷魚足流水解凍，選取粗細相同，表皮色澤相近的，清洗干凈，切成20cm左右的小段，備用。

1.2.2 蛋白酶活力的測定及篩選 根據文獻［8］測定酶活力并在料液比2∶10（m∶V）、加酶量0.30%的條件下，選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及動物蛋白水解酶4種蛋白酶分別在各自最適作用條件［9］下對魷魚足進行酶解去皮30min，以酶解去皮后L＊和感官評分為指標進行比較，選取最優(yōu)酶。

1.2.3 優(yōu)選酶酶解工藝的單因素試驗 考慮到實際生產的便利性和優(yōu)選酶動物蛋白水解酶作用特性，試驗pH選7。以感官評分和色差中的L＊值為評價指標，考察料液比、溫度、時間、加酶量對魷魚足酶解去皮效果的影響?；緱l件為溫度60℃、時間30min、加酶量0.20%，改變其中一個條件，其他條件不變，分別考察各因素影響水平。其中各因素水平梯度為料液比1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，6∶10（m∶V）；溫度45，50，55，60，65，70℃；加酶量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%；時間10，20，30，40，50，60min。在單因素的基礎上，選取對去皮效果影響較大的因素作為考察變量，以產品感官評分和L＊值作為響應值設計響應面優(yōu)化酶解魷魚足去皮工藝。

1.2.4 色差的測定 使用美國 Microptix Corporation S560型色差儀測定樣品的L＊、a＊、b＊值。其中，L＊表示亮度，即樣品黑白度；＋a＊表示紅，－a＊表示綠；＋b＊表示黃，－b＊表示藍。

1.2.5 感官評定方法 由12人組成評定小組采用雙盲法［10－12］以肌肉色澤、皮肉脫離程度、組織硬度為感官評評定指標對酶解產品進行打分，評定之前需對評價員進行培訓，明確本試驗的目的意義以及感官評定的指標，評測過程中，各位評價員之間不允許討論交流。1.2.6 對照組與優(yōu)化組質構和顏色的對比驗證 將未經處理的對照組和試驗最終優(yōu)化得到的樣品切成20mm×20mm×20mm的方塊，使用TMS－Pro型質構儀對樣品進行TPA試驗，采用P／5柱形探頭，測試速度為60mm／min，應變量為50%［13］，觸發(fā)力為0.2N，每組平均測定10次。

表1 感官評分標準Table 1 The criteria of sensory evaluation

使用便攜式色差儀對對照組和優(yōu)化組魷魚足肌肉直接進行顏色（RGB）測定。

1.2.7 數據分析 單因素試驗數據用 Microsoft Excel 2007進行分析，測定數據每組至少采用9個平行。結果以平均值±標準偏差表示。響應面優(yōu)化試驗用 Design－expert 8.0.6軟件對數據進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

酶的種類對L＊值和感官評分的影響見表2。由表2可知，不同酶水解魷魚足去皮效果有明顯的不同，其中動物蛋白水解酶效果最好，其次為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶的效果最差。這可能是由于動物蛋白水解酶主要由蛋白內切酶、外切酶和風味酶等組成，可通過內切酶從中間切斷蛋白內部的肽鏈和外切酶從多肽鏈的末端切斷釋放氨基酸，從而使酶作用效果更好。根據比較結果，試驗選取動物蛋白水解酶作為魷魚足去皮工藝的優(yōu)選酶。

2.2 優(yōu)選酶酶解工藝的單因素試驗結果分析

2.2.1 料液比對酶解去皮效果的影響 圖1是不同料液比下的樣品L＊值和感官評分結果。由圖1可知，當料液比在1∶10～2∶10（m∶V）時，L＊值和感官評分隨料液比的增加而迅速增長，當料液比大于2∶10（m∶V）時，感官評分逐漸減小，L＊值變化不明顯，可能是因為單位面積的物料結合的酶量已經過飽和而抑制了酶解反應速率。影響酶解效果的因素有料液比、加酶量、溫度、時間、pH等，但是在工廠實際生產中，料液比極難控制在特定數值上，而且參考徐錦等［14］和馬小燕等［15］在動物蛋白水解酶水解肉類產品的研究中料液比均為2∶10（m∶V），故本試驗料液比確定為2∶10（m∶V）而不再做進一步的響應面優(yōu)化分析。

表2 酶的種類對L＊值和感官評分的影響Table 2 Effect of enzyme on the L＊ value and sensory evaluation value

2.2.2 溫度對酶解去皮效果的影響 酶類為活細胞產生的具有生物催化功能的有機物質有自己的最適反應溫度，在此溫度時，酶具有最高的催化效率，但高于最適溫度后，酶的催化能力會迅速下降。由圖2可知，L＊值隨溫度升高而一直增大，說明魷魚足的顏色一直在變白。感官評分隨著酶解溫度升高亦顯著增加，并于60℃時感官評分達到最大值。但是雖然在大于60℃時，酶的催化能力有所下降，但是不明顯，可能是由于所選溫度范圍尚未達到動物蛋白水解酶大量失活所需溫度。從試驗數據可以看出酶解最適溫度為60℃，這與劉小玲等［16］和危貴茂等［17］研究的動物蛋白水解酶作用最適溫度一致。

2.2.3 加酶量對酶解去皮效果的影響 感官評分和L＊值隨加酶量的變化結果見圖3。由圖3可知，當加酶量從0.05%增加到0.20%時，L＊值和感官評分隨之增加，但添加量大于0.20%后，兩者趨于平緩，幾乎沒有變化。理論上酶加量越大，酶對魷魚足的水解程度就越深，酶除了水解表皮蛋白還會水解肌肉蛋白，這樣感官評分就會降低。但是該單因素試驗中感官評分最終趨于平緩而未有明顯下降，這可能是因為試驗設計的時間較短，使魷魚足肌肉蛋白未受到酶的水解作用。經分析本試驗最適加酶量定為0.20%。

圖1 L＊值和感官評分隨料液比變化曲線Figure 1 Effect of material／liquid ratio on the L＊value and sensory evaluation value

圖2 L＊值和感官評分隨溫度變化曲線Figure 2 Effect of reaction temperature on the L＊value and sensory evaluation value

圖3 L＊值和感官評分隨加酶量變化曲線Figure 3 Effect of enzyme dosage on the L＊value and sensory evaluation value

2.2.4 水解時間對酶解去皮效果的影響 樣品在酶解液中浸泡時間越長，魷魚足質地受到的影響也就越大。由圖4可知，隨著酶解溫度的延長，酶解去皮效果明顯提高，尤其L＊值一直在增大。但是當時間大于40min后，感官評分隨著時間的延長而減小，這是由于隨著酶解時間的延長，魷魚足變軟，失去彈性，直接影響到產品的感官質量。因此，本試驗選取40min作為最適酶解時間。

圖4 L＊值和感官評分隨時間變化曲線Figure 4 Effect of reaction time on the L＊ value and sensory evaluation value

2.3 優(yōu)選酶酶解魷魚足去皮工藝響應面優(yōu)化分析

根據單因素試驗結果，選取對酶解效果影響較大的加酶量、溫度、時間作為考察變量，L＊值（Y1）、感官評分（Y2）為響應值，設計得到三因素三水平的二次回歸方程，擬合自變量和兩個因變量之間的函數關系，利用響應曲面分析法優(yōu)化魷魚足酶法去皮工藝。試驗設計因素水平見表3。

表3 魷魚足酶解去皮響應面設計因素和水平Table 3 Factors and levels in the response surface design

以L＊值（Y1）、感官評分（Y2）為響應值，按照“1.2.3”Box－Benhnken設計進行的試驗結果見表4。通過Design－expert 8.0.6軟件對響應值與各因素的編碼值進行回歸擬合后，得到回歸式：

表4 響應面分析方案及試驗結果Table 4 Response surface design layout and experimental results

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表5和表6。由表5可知，以L＊值為響應值建立的回歸模型具有較高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＝0.213 0＞0.05），模型相關系數R2＝97.54%，修正相關系數R2Adj＝95.33%；由表6可知，以感官評分為指標建立的回歸模型亦具有很高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＝0.117 9＞0.05），模型的相關系數R2＝98.84%，修正相關系數R2Adj＝97.80%，說明模型的擬合程度好，試驗誤差小，可用來分析和預測魷魚足酶法去皮的工藝效果［18－20］。由模型系數顯著性檢驗結果可知，模型的一次項A、B、C對L＊值和感官評分的線性效應極顯著，二次項 A2、B2對工藝的曲面效應極顯著，但是3個因素的交互作用效果不顯著。表明各因素對魷魚足酶法去皮工藝的影響不是簡單的線性關系。從各變量顯著性檢驗P值的大小，可以看出酶解溫度和酶添加量對魷魚足酶解去皮工藝的影響大于酶解時間對其的影響。

2.4 優(yōu)選酶酶解魷魚足去皮工藝的優(yōu)化組合

設定3因素的取值范圍：加酶量0.15%～0.25%、酶解溫度55～65℃、時間30～50min，并將L＊值、感官評分設定為最大值，Design－expert 8.0.6軟件給出的最優(yōu)工藝參數為酶添加量0.25%、溫度61.54℃、時間45min，其理論L＊值為89.93，感官評分值為98.22?？紤]到實際工藝的成本和可行性，將酶解工藝參數修正為加酶量0.25%、溫度61℃、時間45min，根據修正后的最優(yōu)工藝進行3次重復試驗，其L＊值為88.67，感官評分為97.32，此時感官效果為皮肉完全分離，色澤潔白明亮，肉質與原料無差異。

2.5 對照組和優(yōu)化組質構（TPA）及顏色（RGB）對比驗證

質構直接反映肉類的軟硬度和彈性，是肉類產品加工時必須考慮的指標。在試驗中發(fā)現，溫度過高或時間過長會使魷魚足肌肉變軟，彈性減小。由表7可知，優(yōu)化組和原料對照組在肌肉硬度、彈性、內聚性等質構指標上并無很大差異，也就說明該試驗最終確定的酶法去皮處理方案對魷魚足質地上沒有很大影響，這與感官評分結果相一致。

RGB色彩模式是通過對紅（R）、綠（G）、藍（B）3個顏色通道的變化以及它們相互之間的疊加來得到各式各樣的顏色的，幾乎包括了人類視力所能感知的所有顏色，是目前運用最廣的顏色系統之一。試驗中，色差儀直接測定對照組R、G、B值分別為54，50，57，優(yōu)化組分別為253，250，245。對照RGB配色表可以看出優(yōu)化組顏色為乳白色，這與試驗優(yōu)化中和感官評定結果相一致。

3 結論

本試驗通過對動物蛋白水解酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶酶解魷魚足去皮效果的比較，確定動物蛋白水解酶為工藝優(yōu)選酶，并參照單因素試驗選取酶添加量、酶解溫度、時間三因素進行中心組合設計試驗，優(yōu)化動物蛋白水解酶酶解魷魚足去皮的工藝。試驗顯示加酶量、酶解溫度、時間及其3個因素的二次項對酶解效果有極其顯著的影響，最終確定出動物蛋白水解酶酶解魷魚足去皮工藝最佳參數為料液比2∶10（m∶V）、加酶量0.25%、酶解溫度61℃、酶解時間45min，并經過感官評分、L＊值、質構及RGB驗證，在此條件下酶解去皮后魷魚足效果明顯，可直接用于企業(yè)生產環(huán)節(jié)，具有實際應用意義。

表5 試驗中酶因子對L＊值效果影響的方差分析?Table 5 Analysis of variance in the experimental effect of enzyme factors on the L＊ value

表6 試驗中酶因子對感官評分效果影響的方差分析?Table 6 Analysis of variance in the experimental effect of enzyme factors on the sensory evaluation value

表7 對照組和優(yōu)化組質構特性比較Table 7 The texture difference compared control group with optimized group

1 吳少杰，張俊杰，姚興存，等.我國魷魚的綜合加工利用現狀與展望［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：154～155.

2 尹青春，岑燕釗，許純絢，等.魷魚內臟蛋白酶的提取工藝研究［J］.現代食品科技，2012，28（3）：304～305.

3 林燕，王鴻飛，李合生，等.魷魚皮酶解產物的功能特性［J］.中國食品學報，2011，11（5）：83～84.

4 馬永鈞，秦乾安，陳小娥，等.魷魚加工副產物綜合利用研究進展［J］.漁業(yè)現代化，2008，35（4）：62～64.

5 夏松養(yǎng).酶技術在魷魚脫皮中的應用研究［J］.食品工業(yè)科技，2004，25（6）：82～83.

6 唐琳，屠康，潘磊慶，等.基于氣味與顏色的脊尾白蝦新鮮度評價［J］.農業(yè)工程學報，2011，27（9）：344～348.

7 賈艷華，楊憲時，許鐘，等.水分含量對軟烤扇貝質構和色澤的影響［J］.食品與機械，2010，26（3）：47～49.

8 Kamarudlin M S，Jones D A，Vay L L，et al.Ontogenetic change in digestive enzyme activity during larval development of macro brachium rosenbergii［J］.Aquaculture，1994，123（30）：323～330.

9 Wolfgang Aehle.工業(yè)酶－制備與應用［M］.林章凜，李爽，譯.北京：化學工業(yè)出版社，2006.

10 李書紅，王頡，宋春風，等.不同干燥方法對即食扇貝柱理化及感官品質的影響［J］.農業(yè)工程學報，2011，27（5）：373～377.

11 李華，李敏，岳田利.蘋果汁酶解工藝參數對感官品質與香氣構成的影響［J］.農業(yè)機械學報，2010，41（10）：143～146.

12 劉鐵玲，郭芳菲.即食調味青蛤感官質量的模糊綜合評判分析［J］.食品與機械，2009，25（3）：117～119.

13 Anadel Olmo，Jacier Calzada，Pilar Gaya，et al.Proteolysis，texture，and sensory characteristics of serrano hams from duroc and large white pigs during dry‐curing［J］.Journal of Food Sci.，2013，78（3）：418～424.

14 徐錦，李明遠，黃家莉，等.六種商品蛋白酶對鰱魚蛋白水解效果比較研究［J］.中國調味品，2012，7（4）：53～55.

15 馬小燕，陳易彬，李彥軍.酶法水解大鯢蛋白的工藝研究［J］.中國釀造，2009（11）：92～94.

16 劉小玲，林瑩，尹秀華，等.羅非魚皮膠原肽的制備及抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2007（3）：92～93.

17 危貴茂，曾愛民.酶解型南安板鴨的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2006（2）：126～127.

18 唐華麗，熊漢國，王瑋.響應面法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝［J］.食品與機械，2012，28（6）：147～149.

19 易軍鵬，朱文學，馬海樂，等.牡丹籽油超聲波輔助提取工藝的響應面法優(yōu)化［J］.農業(yè)機械學報，2009，40（6）：103～110.

20 Chen Xiao’e，Ningning Xie，Xubo Fang，et al.Optimization of antioxidant hydrolysate production from flying squid muscle protein using response surface methodology［J］.Food and Bioproducts Processing，2012（90）：676～682.