彭登峰 柴春祥 馬 玲 王 偉

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

干酪中添加益生菌可以對(duì)人體起到非常好的作用，嗜酸乳桿菌是人體腸道中的重要微生物，它能調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及抑制腫瘤細(xì)胞形成［1］；雙歧桿菌可以抑制病原菌的生長(zhǎng)，與發(fā)酵乳和酸奶相比，干酪具有較高的pH值，因此干酪更加支持酸敏感性雙歧桿菌的長(zhǎng)期存活［2］；植物乳桿菌具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、緩解乳糖不耐癥及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等多種功能［3］。

酪蛋白抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性［4］。干酪中豐富的酪蛋白是抗菌肽的重要來源。近年來干酪中酪蛋白抗菌肽的抑菌性引起了人們的廣泛關(guān)注和研究。目前已于酪蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抑菌性的抗菌肽［5］。

現(xiàn)階段中國(guó)對(duì)干酪抗菌肽的研究較少。本試驗(yàn)以不同成熟期的添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的3種Mozzarella干酪為原料，用3種方法制備干酪的提取液，驗(yàn)證提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌性。本試驗(yàn)的意義在于驗(yàn)證干酪中提取液的生理功能以及對(duì)微生物的抑制作用，為干酪抗菌肽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)與理論前提。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 原料乳

新鮮牛乳：密度1.030g／mL，干物質(zhì)11.05%，蛋白含量3.03%，酪蛋白含量2.27%，將脂肪標(biāo)準(zhǔn)化至3.0%，使 C／F（酪蛋白∶脂肪）的比值為0.76，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站。

1.1.2 供試菌種

Streptococcus salivarius subsp.thermophilus （唾 液 鏈球 菌 嗜 熱 亞 種 ）CH9、Lactobacillus delbrueckil subsp.bulgaricus（德氏乳桿菌保加利亞亞種）LB、Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳桿菌）、Bifidobacteriasp.（雙歧桿菌）、Lactobacillus plantarum （植 物 乳 桿 菌）、Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備

氫氧化鈉：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

冰醋酸、醋酸鈉、三氯乙酸：均為分析純，天津市嘉興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司；

濾片紙：化學(xué)分析濾紙，杭州特種紙業(yè)有限公司。

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101FA－3型，上海申光儀器儀表有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HPP－9272型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

真空充氣包裝機(jī)：DZQ 550L型，杭州佑天元包裝機(jī)械制造有限公司；

醫(yī)療型潔凈工作臺(tái)：DL－CJ－2F型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Mozzarella干酪的制作 參照文獻(xiàn)［6］來制作 Mozzarella干酪。本試驗(yàn)根據(jù)所加入的發(fā)酵劑不同制備3種Mozzarella干酪。第1種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5%的嗜酸乳桿菌，第2種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5%的雙歧桿菌，第3種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5% 的植物乳桿菌。

1.2.2 Mozzarella干酪抗菌物質(zhì)的提取

（1）無菌蒸餾水提取法：稱取 Mozzarella干酪30g，切碎、研磨后放入燒杯中，加入100mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置1h，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

（2）醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取法：稱取 Mozzarella干酪30g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100mL pH為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

（3）三氯乙酸溶液提取法：稱取Mozzarella干酪30g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100mL 12%的三氯乙酸溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

本試驗(yàn)在干酪成熟40，50，60d時(shí)分3次提取，每次提取時(shí)采用以上3種方式。

1.2.3 菌種活化與接種涂布 將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基裝入試管后擺斜面，在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行菌種斜面活化［7］。

取無菌培養(yǎng)皿，做標(biāo)記后迅速倒入培養(yǎng)基20mL，并快速輕巧地晃動(dòng)培養(yǎng)皿，平置冷卻備用［8］。

分別在培養(yǎng)皿中用移液槍移取少量的無菌蒸餾水，滴到培養(yǎng)皿的中央，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記接種枯草芽孢桿菌，接種時(shí)要將菌融在無菌蒸餾水中，然后用涂布器涂勻。

1.2.4 提取液抗菌活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［8～10］并做適當(dāng)改進(jìn)，采用濾紙片法測(cè)定提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用。

濾紙片法：用無菌鑷子夾住滅菌后的濾紙片分別在不同的提取液中浸泡一下，在瓶口濾去多余樣液，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記貼到相應(yīng)的位置，貼完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.5 空白的制作 分別量取100mL的無菌蒸餾水、pH為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液和12%的三氯乙酸溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁的物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記用濾紙片法測(cè)定3種空白提取液是否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖1可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為40，50，60d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性相差不大，抑菌圈直徑分別為1.00，0.98，1.01cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.93cm；TCA提取的成熟期為40d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.78cm。

圖1 添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 1 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus acidophilus on Bacillus subtilis

2.2 添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖2可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為40d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.18cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.99cm；TCA提取的成熟期為60d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為3.05cm。

圖2 添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 2 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Bifidobacteriaon Bacillus subtilis

2.3 添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

圖3 添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 3 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumon Bacillus subtilis

圖4 不同成熟期添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌性Figure 4 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumduring different ripening on Bacillus subtilis

由圖3、圖4可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為60d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.25cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為60d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.18cm；TCA提取的成熟期為40d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為3.28cm。

3 結(jié)論

（1）不同成熟期添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對(duì)枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。

（2）3種提取方法中，TCA提取法提取不同 Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用相對(duì)較好，其制備的提取液可能含有更多種類的抗菌肽。

（3）用TCA提取法提取出添加嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪成熟40d時(shí)的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為2.78cm和3.28cm。

（4）用TCA提取法提取出添加雙歧桿菌的 Mozzarella干酪成熟60d時(shí)的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為3.05cm。

（5）添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液主要含有酪蛋白，酪蛋白具有豐富的生物活性序列［11］，酪蛋白抗菌肽通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞呼吸和DNA合成等機(jī)制來達(dá)到抑制枯草芽孢桿菌的作用。隨著干酪的成熟，酪蛋白在凝乳酶和發(fā)酵劑微生物產(chǎn)生的蛋白分解酶的作用下形成抗菌肽。添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌對(duì)Mozzarella干酪的成熟有一定的影響，從而影響抗菌肽的形成，同時(shí)，提取方法不同，提取液中所含的肽類不同或者濃度不同，從而對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌性不同，TCA提取法制備出的提取液可能含抗菌肽的濃度大或者種類多，抑菌圈直徑較大。至于嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌對(duì)Mozzarella干酪提取液抗菌性的影響，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

1 王欣，劉飛，霍貴成.傳統(tǒng)乳制品中嗜酸乳桿菌的生理特性研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：87～92.

2 Corbo M R，Albenzio M，De Angelis M，et al.Microbiological and biochemical properties of canestrato pugliese hard cheese supplemented with bifidobacteria［J］.Journal of Dairy Science，2001，84（3）：551～561.

3 王水泉，包艷，董喜梅.植物乳桿菌的生理功能及應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12（4）：49～55.

4 鄭俏然，李誠(chéng).胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白產(chǎn)物抑菌特性的研究［J］.食品科技，2009，34（6）：179～181.

5 杜軍，袁永俊，侯恩娟，等.酪蛋白酶解物中抗菌肽的抑菌性及穩(wěn)定性研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40（1）：22～24.

6 劉會(huì)平，南慶賢，馬長(zhǎng)偉，等.不同工藝參數(shù)對(duì)Mozzarella干酪質(zhì)構(gòu)和功能特性的影響［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006，6（2）：20～28.

7 宗緒巖，李麗，羅惠波，等.啤酒糟蛋白水解物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌能力研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28（1）：108～111.

8 趙玲，曹榮，劉淇，等.南極磷蝦酶解提取液的抑菌活性［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2011，32（4）：112～116.

9 黃小炯，區(qū)子弁.銀杏抗菌蛋白的提取及其抗菌性研究［J］.食品工業(yè)科技，2008（10）：139～145.

10 王元清，嚴(yán)建業(yè)，羅堃，等.蟾皮提取物抑菌活性與穩(wěn)定性研究［J］.食品與機(jī)械，2011，27（5）：120～122.

11 袁永俊，胡婷，朱家驊，等.酪蛋白抗菌肽的酶法制備［J］.食品與機(jī)械，2010，26（2）：1～4.