王繼偉 葛英亮 于 晉 吉亞力 謝玉鋒

（1.哈爾濱學(xué)院工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，黑龍江 哈爾濱 150080；2.哈爾濱師范大學(xué)管理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090）

食品生物抑菌劑本身即為食品的組成成分，所以具有安全、高效、價(jià)廉的特點(diǎn)［1］，是純綠色生態(tài)制劑［2］，具有很好的發(fā)展前景［3］。目前，在食品中常用的生物抑菌劑主要為乳酸鏈球菌素（nisin）和那他霉素（natamycin），抑菌效果好，生產(chǎn)成本較高，應(yīng)用不夠廣泛。納豆芽孢桿菌 （Bacillus natto）屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌［4］，通常為（0.7～0.8）μm×（2.0～3.0）μm，革蘭氏陽(yáng)性菌，其芽孢呈橢圓形或柱狀，適宜在中性或偏酸性環(huán)境中生存［5］，該菌有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。納豆芽孢桿菌是有益菌，耐酸，在胃酸下4h存活率為100%［6］，同時(shí)具有強(qiáng)力的病原菌抑制能力［7］，是各種有益菌當(dāng)中對(duì)環(huán)境耐受力最好的菌種之一［8］。含有納豆芽孢桿菌的食品，可抵抗胃酸等物質(zhì)的殺滅作用，進(jìn)入小腸，能改變?nèi)梭w腸道菌叢生態(tài)，調(diào)節(jié)腸道菌群，幫助消化道機(jī)能正?；?］，同時(shí)增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞免疫反應(yīng)［10］。關(guān)于納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抑菌功能的研究［11－13］已經(jīng)逐漸開始，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物中可能含有2，6－吡啶二羧酸、桿菌肽、多粘菌素等物質(zhì)，對(duì)食品中常見的污染菌和致病菌具有很強(qiáng)的抑菌效果［14］。

本試驗(yàn)擬從納豆中篩選分離納豆芽孢桿菌，發(fā)酵提取次生代謝產(chǎn)物，研究該代謝產(chǎn)物對(duì)食品中常見的污染菌及致病菌的抑菌效果，為開發(fā)新型的食品生物抑菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆：食品級(jí)，哈爾濱日尚食品有限公司、黑龍江鑫東方食品有限公司；

牛肉膏：北京圣倫食品有限公司；

蛋白胨：山東梁山科鑫生物制品有限公司；

葡萄糖：分析純，上海西王淀粉糖有限公司；

KH2PO4、K2HPO4：分析純，武漢南輕科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1 000mL，pH值7.4～7.6；

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，自來(lái)水1 000mL。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平：FA2204B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LHR系列，上海一恒科技有限公司；

搖床培養(yǎng)箱：BS－1E型，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ－LS－50S型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

離心機(jī)：80－2型，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 納豆芽孢桿菌及指示菌的分離、純化及保藏 納豆芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等指示菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，微球菌、根霉、米曲霉、毛霉采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，并純化保存。

1.4.2 梯度稀釋法確定納豆芽孢桿菌的菌液濃度 采用梯度稀釋法統(tǒng)計(jì)發(fā)酵28h后，液體培養(yǎng)基中的納豆芽孢桿菌菌液濃度。

1.4.3 納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的確定 取已知濃度的納豆芽孢桿菌菌液，采用牛津杯法衡量納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果，以菌液稀釋倍數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以其對(duì)各指示菌作用產(chǎn)生抑菌圈直徑的大小為指標(biāo)，建立因素水平表，選取兩種具有代表性的指示菌，確定納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物最佳抑菌條件。

（1）菌液稀釋倍數(shù)的影響：改變菌液的稀釋倍數(shù)，作用于指示菌，37℃培養(yǎng)28h后測(cè)量抑菌圈直徑，探究菌液濃度對(duì)納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響。

（2）發(fā)酵溫度的影響：在不同溫度梯度（34，35，36，37，38，39，40℃）下培養(yǎng)28h。培養(yǎng)結(jié)束后，梯度稀釋后作用于指示菌，測(cè)量抑菌圈直徑，探究發(fā)酵溫度對(duì)納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響。

（3）發(fā)酵時(shí)間的影響：在37℃下分別培養(yǎng)18，20，22，24，26，28，30，32h，梯度稀釋后作用于指示菌，測(cè)量抑菌圈直徑，探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響。

1.4.4 高溫對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵液次生代謝產(chǎn)物抑菌功能的影響 將培養(yǎng)好的納豆芽孢桿菌原菌液和經(jīng)梯度稀釋（10，102，103，104倍）的稀釋液，在80 ℃下處理20min后，于37℃培養(yǎng)28h，作用于指示菌，記錄各抑菌圈直徑，并與未高溫培養(yǎng)時(shí)的抑菌效果做比較。

1.4.5 納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物與Nisin和Natamycin抑菌效果的對(duì)比研究 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，選用較適宜條件下培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，在相同條件下與1%Nisin和1%Natamycin試劑共同作用于各指示菌，并記錄各抑菌圈直徑，分析其抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的菌液濃度

采用梯度稀釋法計(jì)量菌液濃度，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，確定納豆芽孢桿菌菌液中含菌濃度為7.0×106個(gè)／mL。

2.2 發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響

由表1可知，納豆芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋10倍時(shí)，各指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好。發(fā)酵液稀釋1～100倍時(shí)，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物作用于各指示菌有較明顯抑菌圈，且抑菌圈的直徑變化較大，選取此范圍作為抑菌效果響應(yīng)曲面試驗(yàn)中發(fā)酵液濃度范圍。原液抑菌效果比稀釋10倍效果略差，可能因原液的濃度大，黏度大，抑菌物質(zhì)不易擴(kuò)散導(dǎo)致抑菌效果不佳。

表1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵液濃度對(duì)抑菌效果的影響?Table 1 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different concentration

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)其次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響

由表2可知，在37℃下發(fā)酵的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，對(duì)各指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好。發(fā)酵溫度在34～40℃時(shí)，納豆芽孢桿菌處于代謝旺盛期，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較高，且其中抑菌物質(zhì)含量較高，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物作用于各指示菌有較明顯抑菌圈，且抑菌圈直徑變化較大，本試驗(yàn)選取這個(gè)范圍作為納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果響應(yīng)曲面試驗(yàn)中菌液發(fā)酵溫度的使用范圍。

2.4 發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間對(duì)其次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響

由表3可知，發(fā)酵28h時(shí)的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，對(duì)各指示菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好。發(fā)酵時(shí)間在24～32h時(shí)，納豆芽孢桿菌發(fā)育處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和持續(xù)期，其分泌代謝產(chǎn)物產(chǎn)量能夠維持在一定水平，具有較好的抑菌效果，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物作用于各指示菌有較明顯抑菌圈，且抑菌圈的直徑變化較大，本試驗(yàn)則選取這個(gè)范圍作為納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果響應(yīng)曲面試驗(yàn)中菌液發(fā)酵時(shí)間的使用范圍。

2.5 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應(yīng)曲面試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)3組單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定出納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果BBD正交試驗(yàn)的因素水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

式（1）為采用因素代碼形式的金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑與各操作因素之間關(guān)系的二次方程模型：Y1＝13.20＋0.78A ＋0.15B －0.050C＋0.32AB ＋0.13AC＋0.38BC－2.06A2－2.5B2－1.71C2（1）

由響應(yīng)曲面試驗(yàn)可知，在3個(gè)因素交互作用（圖1～3）下，對(duì)抑菌效果的影響順序是：（發(fā)酵溫度×發(fā)酵時(shí)間）＞（菌液稀釋倍數(shù)×發(fā)酵時(shí)間）＞（菌液稀釋倍數(shù)×發(fā)酵溫度）。從單個(gè)因素影響來(lái)看，菌液稀釋倍數(shù)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果影響最大，且在所選的試驗(yàn)水平范圍內(nèi)存在最優(yōu)響應(yīng)因子水平。由回歸方程確定針對(duì)金黃色葡萄球菌的納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物的最佳抑菌條件：菌液稀釋59.94倍、發(fā)酵溫度37.12℃、發(fā)酵時(shí)間27.99h。選取抑菌條件將菌液稀釋60倍，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間28h，納豆芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌圈直徑為13.7mm，確為最大值，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好。

表2 發(fā)酵溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌效果的影響?Table 2 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different fermentation temperature

表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌效果的影響?Table 3 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different fermentation time

表4 BBD正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 The BBD orthogonal factors level table

表5 BBD正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The BBD orthogonal test program and test results

2.6 對(duì)根霉菌抑菌效果的響應(yīng)曲面試驗(yàn)

根據(jù)所列正交試驗(yàn)因素水平表得到納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)根霉菌抑菌效果BBD正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

式（2）為采用因素代碼形式的根霉菌抑菌圈直徑與各操作因素之間關(guān)系的二次方程模型：

由響應(yīng)曲面試驗(yàn)可知，在3個(gè)因素交互作用（圖4～6）下，對(duì)抑菌效果的影響順序是：（發(fā)酵溫度×發(fā)酵時(shí)間）＞（菌液稀釋倍數(shù)×發(fā)酵時(shí)間）＞（菌液稀釋倍數(shù)×發(fā)酵溫度）。從單個(gè)因素影響來(lái)看，菌液稀釋倍數(shù)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果影響最大，且在所選的試驗(yàn)水平范圍內(nèi)存在最優(yōu)響應(yīng)因子水平。由回歸方程確定針對(duì)根霉菌的納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物的最佳抑菌條件：菌液稀釋56.31倍、發(fā)酵溫度37.02℃、發(fā)酵時(shí)間27.67h。將菌液稀釋56倍、發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時(shí)間為27.6h時(shí)，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)根霉菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑為12.1mm。

2.7 高溫處理后的納豆芽孢桿菌對(duì)其次生代謝產(chǎn)物抑菌功能的影響

高溫處理后納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果見表6。高溫處理納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，可使納豆芽孢桿菌處于芽孢狀態(tài)，使得部分酶類變性失活，可驗(yàn)證納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物中化學(xué)物質(zhì)起抑菌作用。經(jīng)高溫后的納豆芽孢桿菌，其次生代謝產(chǎn)物仍具有抑菌功能，但其抑菌效力有所降低。

圖1 菌液稀釋倍數(shù)－發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 1 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation temperature

圖2 菌液稀釋倍數(shù)－發(fā)酵時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 2 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation time

圖3 發(fā)酵溫度－發(fā)酵時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 3 The response surface and contour of the interaction with fermentation temperaturefermentation time

表6 高溫處理后納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物抑菌效果?Table 6 The bacteriostatic efficacy of the Bacillus nattotunning by high temperature

2.8 納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物與Nisin和Natamycin試劑抑菌效果的對(duì)比

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，稀釋10倍的納豆芽孢桿菌在37℃下發(fā)酵28h后，其次生代謝產(chǎn)物具有較好抑菌效果。用此條件下的納豆芽孢桿菌發(fā)酵液與Nisin及Natamycin對(duì)比抑菌效果，結(jié)果見表7。

由表7可知，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物與Nisin、Natamycin均具有廣譜抗菌作用，對(duì)多種微生物都有抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果尤其顯著。納豆芽孢桿菌發(fā)酵液較前二者抑菌效果略差，但從安全性，以及生產(chǎn)成本看，更有開發(fā)價(jià)值。如果進(jìn)一步研究，有可能使納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌效果達(dá)到甚至超過(guò)前二者。

圖4 菌液稀釋倍數(shù)－發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 4 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation temperature

圖5 菌液稀釋倍數(shù)－發(fā)酵時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 5 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation time

圖6 發(fā)酵溫度－發(fā)酵時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Figure 6 The response surface and contour of the interaction with fermentation temperature and fermentation time

3 結(jié)論

通過(guò)以上研究可知，納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌及根霉等微生物都具有很好的抑菌效果，最優(yōu)條件：金黃色葡萄球菌，納豆芽孢桿菌發(fā)酵液濃度稀釋59.94倍，發(fā)酵溫度37.12℃，發(fā)酵時(shí)間27.99h；根霉菌，納豆芽孢桿菌發(fā)酵液濃度稀釋56.31倍，發(fā)酵溫度37.02℃，發(fā)酵時(shí)間27.67h。試驗(yàn)結(jié)果也表明，在37℃下發(fā)酵28h，經(jīng)80℃處理20min的納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物仍具有抑菌功能，但抑菌效力有所降低。納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物與Nisin、Natamycin類似，均具有廣譜抗菌作用，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果尤其顯著。

表7 納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物與Nisin及納他霉素的抑菌效果對(duì)比?Table 7 The bacteriostatic efficacy contrast of the tunning of Bacillus natto ，Nisin and Natamycin

今后的研究將對(duì)納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)物成分分析及使用安全性進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1 Eduardo Marcos Balciunas，F(xiàn)abio Andres Castillo Martinez，Svetosla Dimitrov Todorov，et al.Novel biotechnological applications of bacteriocins：A review［J］.Food Control，2013（32）：134～142

2 Ozawa K，Yagu－Uchi K，Yamanaka K，et al.Antagonistic effects of Bacillus natto and Streptococcus faecalia on growth of Candida albicans［J］.Microbial Immunes，1979，23（12）：1 147～1 156.

3 楊亞平.中國(guó)應(yīng)重視納豆的研制和推廣［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2001（1）：25～27.

4 宋永生，張炳文.日本納豆與中國(guó)豆豉營(yíng)養(yǎng)功能成分的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)調(diào)味品，2004（12）：6～7.

5 薄金嶺.納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.大豆通報(bào)，2004，30（2）：22～23.

6 易燦，蔣立文.納豆菌代謝產(chǎn)物抗菌作用的研究現(xiàn)狀與展望［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2008（5）：64～67.

7 熊曉輝，梁劍光，熊強(qiáng)，等.納豆激酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（1）：63～66.

8 張錦華，王萍，何后軍.納豆提取物和納豆菌的體外抑菌作用研究［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2006（6）：8～42.

9 蘇麗萍.納豆菌所具有的抗菌活性——對(duì)于O－157的抑菌效果［J］.世界科學(xué)，1997（11）：30.

10 沙維，劉妍妍，陳景鑫，等.利用豆粕浸提液發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（11）：199～202.

11 孔繁東，魯玉蠶.蛹納豆菌發(fā)酵抗菌性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（11）：213～215.

12 劉變方，石磊，喬冬玲，等.抑菌型納豆菌株的分離篩選及其微生態(tài)菌劑的制備［J］食品工業(yè)科技，2011，32（12）：210～217.

13 鐘青萍，余世望，梁勝媛.納豆菌的抗菌作用及其培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2001，22（5）：20～22.

14 陳建軍，黃純純，張巧央，等.微波等離子體選育高抗菌活性納豆芽孢桿菌研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2012，48（2）：21～24.