李 濱 汪麗燕 蔣歡歡

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(534001)

Periostin又稱成骨細(xì)胞特異性因子2(osteoblast-specific factor 2，OSF-2)，是一種基質(zhì)特異性細(xì)胞黏附分子，其cDNA最初是在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中被克隆和鑒定的［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)periostin過表達(dá)與多種惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2］。除促進(jìn)細(xì)胞黏附外，periostin還具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、增殖、遷移、侵襲、血管生成等作用，并與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥有關(guān)［3～9］。順鉑(cisplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)為常用胃癌化療藥物［10～12］，然而由于腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的獲得［13］，相當(dāng)一部分胃癌患者化療效果不甚理想。因此，探討胃癌化療耐藥的產(chǎn)生機(jī)制對提高化療效果、延長患者生存期具有重要意義。有研究顯示periostin與受體結(jié)合后，可通過PI3K/Akt通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［2］，另有研究發(fā)現(xiàn)基因突變或缺失所致的p53失活是胃癌細(xì)胞化療耐藥的重要機(jī)制之一［14］。本課題組前期研究［15］發(fā)現(xiàn) periostin過表達(dá)可增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901對順鉑和5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗能力，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥，本研究對periostin過表達(dá)是否系通過激活A(yù)kt通路抑制p53表達(dá)而誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞對順鉑和5-Fu的耐藥性進(jìn)行了探討。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑、儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(American Type Culture Collection)，表達(dá)人periostin全長序列的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-periostin(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科構(gòu)建、保存［16］)。順鉑、5-Fu(Sigma-Aldrich Co.)，Akt特異性抑制劑 MK-2206(Selleck Chemicals)，兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗體、小鼠抗人p53單克隆抗體、小鼠抗人 β-actin單克隆抗體、兔 IgG-HRP、小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，Amersham ECL Plus蛋白質(zhì)印跡法檢測試劑盒(Life Sciences，GE Healthcare)，BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences)。Tanon-4100全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，EPICS?ALTRATM流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Inc.)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):SGC-7901細(xì)胞使用RPMI1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液一次。細(xì)胞生長至70% ～80%融合時，按1∶3的比例進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

2.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-periostin重組質(zhì)粒和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1空載體SGC-7901細(xì)胞株的構(gòu)建步驟參照本課題組前期研究［16］。

3.細(xì)胞處理:periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組和空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組SGC-7901細(xì)胞分別以5 μmol/L順鉑或10 μmol/L 5-Fu處理24 h或不予化療藥物處理，其中periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組在化療藥物處理前可接受或不接受1 μmol/L MK-2206(Akt特異性抑制劑)預(yù)處理30 min。同時設(shè)置未予轉(zhuǎn)染、亦未予化療藥物處理和未予轉(zhuǎn)染、但予化療藥物處理的對照組。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測總Akt、p-Akt、p53蛋白表達(dá):將各組細(xì)胞按5×105/孔接種于12孔板并予相應(yīng)處理，細(xì)胞密度達(dá)到70% ～80%時收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃ 14 000×g離心15 min，吸取上清液，液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩CA法蛋白定量，取20 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳1.5 h，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1000)室溫孵育2 h，1×TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000)室溫孵育 1 h，1×TBST洗膜 10 min×3次，按Amersham ECL Plus蛋白質(zhì)印跡法檢測試劑盒說明書進(jìn)行顯影、定影操作，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描、觀察。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將經(jīng)相應(yīng)處理的各組細(xì)胞制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL移入流式細(xì)胞儀專用試管，預(yù)冷PBS洗滌3次，300×g離心10 min，棄上清液，按 BD PharmingenTMAnnexin V∶FITC凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色完畢后立即上流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm(Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞)和620 nm(PI染色陽性細(xì)胞)。Annexin VFITC染色陽性為早期凋亡細(xì)胞，PI染色陽性為壞死細(xì)胞，兩者均陽性為晚期凋亡細(xì)胞，兩者均陰性為正常活細(xì)胞。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、Periostin過表達(dá)激活SGC-7901細(xì)胞的Akt通路

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組SGC-7901細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)明顯高于空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組和未予轉(zhuǎn)染的對照組，三組間總Akt蛋白表達(dá)無明顯差異(見圖1)，表明periostin過表達(dá)可誘導(dǎo) SGC-7901細(xì)胞Akt磷酸化水平增加，激活A(yù)kt通路。

圖1 各組 SGC-7901細(xì)胞總 Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較(蛋白質(zhì)印跡法)

圖2 各組經(jīng)順鉑或5-Fu處理的SGC-7901細(xì)胞p53蛋白表達(dá)比較(蛋白質(zhì)印跡法)

二、Periostin通過激活A(yù)kt通路抑制SGC-7901細(xì)胞p53表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，在經(jīng)順鉑或5-Fu處理的各組SGC-7901細(xì)胞中，periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組p53蛋白表達(dá)明顯低于空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組和未予轉(zhuǎn)染的對照組，而經(jīng)Akt特異性抑制劑MK-2206預(yù)處理的periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞，p53蛋白表達(dá)下調(diào)有所逆轉(zhuǎn)(見圖2)，表明抑制Akt可在一定程度上逆轉(zhuǎn)periostin對p53表達(dá)的抑制作用，periostin至少部分是通過激活A(yù)kt通路抑制SGC-7901細(xì)胞的p53表達(dá)。

三、Akt通路對periostin在SGC-7901細(xì)胞中抗凋亡活性的作用

流式細(xì)胞分析顯示，在經(jīng)順鉑或5-Fu處理的各組SGC-7901細(xì)胞中，periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞凋亡率顯著低于空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組和未予轉(zhuǎn)染的對照組，而經(jīng)Akt特異性抑制劑MK-2206預(yù)處理的periostin穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率降低有所逆轉(zhuǎn)(見圖3)，表明抑制Akt可在一定程度上逆轉(zhuǎn)periostin誘導(dǎo)的凋亡保護(hù)效應(yīng)，Akt通路活化對periostin在SGC-7901細(xì)胞中的抗凋亡活性具有重要意義。

圖3 各組SGC-7901細(xì)胞順鉑或5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比較(流式細(xì)胞分析)

討 論

腫瘤細(xì)胞耐藥性的獲得是腫瘤治療失敗的主要原因之一，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和死亡。盡管圍繞胃癌耐藥機(jī)制的研究已取得一定進(jìn)展，但其確切機(jī)制迄今尚未完全闡明。本課題組前期研究［15］探討了periostin基因?qū)ξ赴┗熋舾行缘恼{(diào)控作用，結(jié)果顯示過表達(dá)外源性periostin可增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901對順鉑和5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗能力，伴線粒體細(xì)胞色素C釋放、凋亡效應(yīng)分子caspase-3激活及其底物PARP剪切減少，以及促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)、腫瘤抑制蛋白p53表達(dá)下調(diào)(部分研究結(jié)果未發(fā)表)。因此，periostin過表達(dá)可能為人胃癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的原因之一。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上探討了periostin過表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞化療耐藥性的可能機(jī)制。

PI3K/Akt通路活化對于腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡刺激而存活具有重要意義。Akt由PI3K激活后，可直接影響凋亡機(jī)制，或影響凋亡刺激引起的轉(zhuǎn)錄因子活性改變［17］。有研究［18］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中過表達(dá)的periostin可激活A(yù)kt/PKB通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活和腫瘤轉(zhuǎn)移性生長。同樣，在非小細(xì)胞肺癌中，缺氧引起的periostin過表達(dá)可通過激活A(yù)kt/PKB通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中存活［19］。本研究結(jié)果顯示periostin過表達(dá)可誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞Akt磷酸化水平增加，但對總Akt無明顯影響，表明periostin過表達(dá)可激活人胃癌細(xì)胞的Akt通路。進(jìn)一步檢測Akt通路活化在periostin抑制p53表達(dá)中的作用，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)順鉑或5-Fu處理的SGC-7901細(xì)胞中，periostin可抑制化療藥物誘導(dǎo)的p53表達(dá)上調(diào)，而Akt特異性抑制劑預(yù)處理可在一定程度上逆轉(zhuǎn)periostin對p53表達(dá)的抑制作用，表明periostin至少部分是通過激活A(yù)kt通路抑制人胃癌細(xì)胞的p53表達(dá)。最后，本研究探討了periostin的抗凋亡活性是否依賴于激活A(yù)kt通路，結(jié)果顯示periostin可抑制順鉑和5-Fu誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞凋亡，而Akt特異性抑制劑預(yù)處理可在一定程度上逆轉(zhuǎn)periostin誘導(dǎo)的凋亡保護(hù)效應(yīng)，表明Akt通路活化對periostin在人胃癌細(xì)胞中的抗凋亡活性具有重要意義。

p53是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)分子，其活化后可經(jīng)由廣泛的信號網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，通過外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;在特定條件下，p53還能通過非轉(zhuǎn)錄依賴性機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。而激活A(yù)kt通路能增強(qiáng)MDM2對p53活性的抑制能力，通過影響p53家族活性而發(fā)揮抗凋亡作用［17，20］。本研究發(fā)現(xiàn)，在人胃癌細(xì)胞中，過表達(dá)外源性periostin可致Akt通路活化，而Akt特異性抑制劑MK-2206可部分逆轉(zhuǎn)periostin抑制化療藥物誘導(dǎo)的p53表達(dá)上調(diào)和腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，證實(shí)Akt為p53的上游調(diào)控因子。

Periostin與Akt通路的相關(guān)性在其他細(xì)胞背景中亦有報道，如periostin可通過Akt通路誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞侵襲［21］、參與急性心肌梗死時活化成纖維細(xì)胞的募集以促進(jìn)修復(fù)［22］等;在頸動脈損傷時以及體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中，periostin表達(dá)上調(diào)系由PI3K/Akt依賴性通路所介導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移［23］。綜合上述研究發(fā)現(xiàn)以及本研究結(jié)果，periostin多種生物學(xué)功能的發(fā)揮與Akt通路有關(guān)，通過激活A(yù)kt通路抑制p53表達(dá)可能是periostin過表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞化療耐藥性的機(jī)制之一，有望作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

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