姜宗丹 張振玉* 孔超美 趙有財(cái) 王勁松 黃文斌

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科1(210006) 病理科2

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)、克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，其發(fā)病率逐年增高，但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為腸黏膜屏障功能失調(diào)參與了UC的發(fā)生。

腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障等組成，其中機(jī)械屏障由黏膜上皮細(xì)胞及其各種連接結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。位于上皮細(xì)胞頂端的緊密連接是構(gòu)成上皮機(jī)械屏障功能最主要的結(jié)構(gòu)，可維持細(xì)胞極性和通透性，在大分子物質(zhì)是否通過屏障的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。緊密連接一旦發(fā)生變異、損傷、降低或缺失，會引起細(xì)胞間隙通透性增加，從而引起腸黏膜損傷。occludin和 ZO-1(zonula occluden-1)是構(gòu)成緊密連接的主要跨膜蛋白的重要組成部分，參與細(xì)胞間黏附、移動、調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性以及細(xì)胞表型的改變［1］。本研究通過采用免疫組化法檢測美沙拉嗪治療前后occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)情況，旨在探討美沙拉嗪對UC腸黏膜緊密連接蛋白的影響。

對象與方法

一、研究對象

選取2010年12月～2011年6月南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院收治的活動期UC患者30例，其中男15例，女15例，年齡 22～58歲，平均(41.5±9.1)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年“對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見”，根據(jù)臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡和組織病理學(xué)檢查結(jié)果作出UC的診斷。排除標(biāo)準(zhǔn):①對本藥物過敏者;②正接受其他5-氨基水楊酸(5-ASA)衍生物治療(或停用＜1周)者;③伴隨其他嚴(yán)重的進(jìn)展性疾病者;④有腸道切除術(shù)史者;⑤妊娠、哺乳期婦女。按Sutherland疾病活動指數(shù)來判斷UC的輕、中、重度活動期和緩解期，7例輕度活動期，其余為中度活動期。所有病例治療兩個月后復(fù)查結(jié)腸鏡顯示均為緩解期。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會審批通過。

二、研究方法

1.給藥方法和標(biāo)本采集:患者入選后給予餐后口服美沙拉嗪［希米科醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展(北京)有限公司］1.0 g，3次/d，共8周。分別于患者就診時和治療緩解后以內(nèi)鏡活檢鉗取乙狀結(jié)腸病變標(biāo)本2塊。

2.免疫組化SABC法:取結(jié)腸組織，蠟塊切片、烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，高溫高壓抗原修復(fù)，非免疫血清封閉。分別加入兔抗人多克隆occludin、ZO-1抗體(均購自 Cell Signaling Technology，滴度均為1∶200)孵育，4℃過夜;加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體37℃ 20 min;加入SABC(武漢博士德生物工程有限公司)37℃ 20 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明樹膠封片。PBS液代替一抗作為空白對照。

結(jié)果判斷:陽性程度判定標(biāo)準(zhǔn)參照袁小凌等［2］的方法，結(jié)果由兩位病理醫(yī)師以雙盲法獨(dú)立觀察確定。低倍鏡下觀察occludin和ZO-1在腸上皮細(xì)胞的分布特征，每張切片選取5處occludin和ZO-1染色集中區(qū)，高倍鏡下(×200)觀察并計(jì)數(shù)，求均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、occludin蛋白

occludin蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)。治療前occludin蛋白表達(dá)較弱，呈淡黃色，陽性細(xì)胞率0～10%，以美沙拉嗪治療后occludin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P=0.000)(見表1、圖1)。

表1 UC患者治療前后occludin和ZO-1蛋白表達(dá)變化()

表1 UC患者治療前后occludin和ZO-1蛋白表達(dá)變化()

組 別 例數(shù)occludin ZO-1治療前30 1.60 ±0.55 1.40 ±0.55治療后 30 7.20 ±1.55 6.60 ±1.26 t值49.426 1.745 P值0.000 0.000

二、ZO-1蛋白

ZO-1蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)。治療前ZO-1蛋白表達(dá)較弱，呈淡黃色，陽性細(xì)胞率0～10%，以美沙拉嗪治療后ZO-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P=0.000)(見表1、圖 2)。

圖1 治療前后occludin蛋白的表達(dá)(免疫組化SABC法，×200)

圖2 治療前后ZO-1蛋白的表達(dá)(免疫組化SABC法，×200)

討 論

UC的重要特征之一為急性發(fā)作時白細(xì)胞從血管內(nèi)游走到腸黏膜造成炎性細(xì)胞浸潤，即中性粒細(xì)胞(PMN)穿過上皮細(xì)胞進(jìn)行遷移，這種現(xiàn)象稱為PMN跨上皮遷移。有研究［3］觀察PMN跨上皮遷移與結(jié)腸上皮細(xì)胞連接蛋白的關(guān)系，以免疫熒光法檢測急性發(fā)作期UC患者PMN區(qū)和非PMN區(qū)結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白(occludin、claudin-1、ZO-1和JAM)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性炎癥PMN區(qū)所有被測蛋白表達(dá)均下降，而非PMN區(qū)僅occludin表達(dá)下降，因此認(rèn)為occludin丟失是UC的重要表現(xiàn)，與UC引起的細(xì)胞膜滲透性增加有關(guān);其他連接蛋白表達(dá)下降僅出現(xiàn)在PMN區(qū)，推測這些蛋白下調(diào)是 PMN遷移后快速可逆的一個過渡過程。

緊密連接是細(xì)胞間連接的重要形式之一，可由claudin蛋白、occludin蛋白、JAM、ZOs等結(jié)構(gòu)蛋白以及各類連接蛋白分子共同組成［4］，occludin是最先分離出來的緊密連接跨膜蛋白［5］，相對分子質(zhì)量為65 kDa(1 Da=0.9921 u)，包含2個細(xì)胞外環(huán)和1個短的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。免疫電鏡顯示occludin蛋白定位于緊密連接上［6］，其不僅能通過細(xì)胞外環(huán)以拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合的方式產(chǎn)生嚴(yán)密的細(xì)胞旁封閉，還能與不同的分子結(jié)合參與緊密連接形成的信號調(diào)節(jié)［7，8］。occludin與ZO-1可形成緊密連接蛋白的基本結(jié)構(gòu)，功能涉及細(xì)胞間黏附、移動、調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性以及細(xì)胞表型的改變［1］。低氧、炎性因子刺激等病理情況可引起occludin、ZO-1蛋白等分布異常、表達(dá)減少甚至融解，導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的異常，細(xì)胞間隙增寬，進(jìn)而使內(nèi)皮層通透性升高［9］，發(fā)生損傷。電子顯微鏡證實(shí)，緊密連接在炎癥損傷中的表達(dá)逐漸減少［10］。

美沙拉嗪為5-ASA的控釋劑型，定向在回腸末端和結(jié)腸釋放，可抑制結(jié)腸過氧化物酶和黏膜釋放白三烯、前列腺素E，抑制巨噬細(xì)胞向炎癥遷移以及血小板活化因子的活性，消除氧自由基等損傷因子，抑制激活的白細(xì)胞產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)而發(fā)揮抗炎作用。UC時腸黏膜屏障功能異常，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)向腸黏膜固有層易位并激活固有層免疫細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)，進(jìn)一步損傷腸黏膜屏障功能，使腸上皮細(xì)胞緊密連接發(fā)生變異、減少或缺失，導(dǎo)致細(xì)胞間隙通透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)菌、內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)通過緊密連接進(jìn)入體循環(huán)［11，12］。美沙拉嗪可抑制激活白細(xì)胞產(chǎn)生炎癥發(fā)揮抗炎作用，從而抑制炎癥介導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷。

本研究采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪治療后UC患者腸黏膜上皮細(xì)胞occludin、ZO-1蛋白表達(dá)均明顯升高，患者內(nèi)鏡下取得緩解。說明美沙拉嗪可能通過上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1的表達(dá)來保護(hù)腸黏膜屏障功能，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討證實(shí)。

1 劉理，楊宗城，黎鰲.緊密連接的分子基礎(chǔ)及其調(diào)控［J］.國外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊，1999，19(1):75-77.

2 袁小凌，劉潔，楊淑麗，等.3-MA和PDTC聯(lián)合應(yīng)用對大鼠急性壞死性胰腺炎的協(xié)同保護(hù)作用［J］.胃腸病學(xué)，2013，18(2):76-81.

3 Kucharzik T，Walsh SV，Chen J，et al.Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins［J］.Am J Pathol，2001，159(6):2001-2009.

4 宋紅麗，呂颯，馬力，等.TNF-α影響腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)［J］.世界華人消化雜志，2004，12(6):1303-1306.

5 Chen YH，Lu Q，Goodenough DA，et al.Nonreceptor tyrosine kinase c-Yes interacts with occludin during tight junction formation in canine kidney epithelial cells［J］.Mol Biol Cell，2002，13(4):1227-1237.

6 Furuse M，Hirase T，Itoh M，et al.Occludin:a novel integral membrane protein localizing at tight junctions［J］.J Cell Biol，1993，123(6 Pt 2):1777-1788.

7 Hirase T，Staddon JM，Saitou M，et al.Occludin as a possibledeterminantoftightjunction permeabilityin endothelial cells［J］.J Cell Sci，1997，110(Pt 14):1603-1613.

8 Nusrat A，Chen JA，F(xiàn)oley CS，et al.The coiled-coil domain of occludin can act to organize structural and functional elements of the epithelial tight junction［J］.J Biol Chem，2000，275(38):29816-29822.

9 Berkes J，Viswanathan VK，Savkovic SD，et al.Intestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier，ion transport，and inflammation［J］.Gut，2003，52(3):439-451.

10 Kleeff J，Shi X，Bode HP，et al.Altered expression and localization of the tight junction protein ZO-1 in primary and metastatic pancreatic cancer［J］.Pancreas，2001，23(3):259-265.

11 何新穎，唐志鵬，張亞利.腸上皮屏障與炎癥性腸病研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2008，16(29):3316-3320.

12 秦環(huán)龍，高志光.腸上皮細(xì)胞緊密連接在腸屏障中的作用研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2005，13(4):443-447.