鞠亞菲 隋牮箐 宋明全 姜相君#

青島大學醫(yī)學院1(266000) 青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院消化內二科2

胃癌是嚴重威脅人類健康的常見消化道腫瘤，近年其發(fā)病率呈逐漸下降的趨勢，但仍是目前第4常見的惡性腫瘤，且死亡率位居所有惡性腫瘤的第二位［1］。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)［2］，發(fā)病年齡以中老年居多［3］。目前胃癌的病因尚未完全闡明，涉及多種因素及其相互的作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人類基因組DNA序列可遺傳變異的主要形式之一，可決定人類疾病的易感性，目前已被廣泛用于疾病病因探索、治療研究、預后評估等反映個體間易感性差異的研究。Runt相關轉錄因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)是近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其基因多態(tài)性與亞洲人群胃癌的發(fā)生可能相關。本研究通過采用DNA直接測序法檢測RUNX3基因rs2236852位點的基因型，旨在探討該位點多態(tài)性與中國漢族人群胃癌發(fā)病的關系，以期初步了解rs2236852多態(tài)性與我國胃癌發(fā)病的關系。

對象與方法

一、研究對象

選取2011年3月～2013年4月青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院確診的310例胃癌住院患者，并排除有胃部疾病以及腫瘤家族史者。同時從青島市市立醫(yī)院體檢中心選取同期327名健康體檢者作為對照組。標本采集均獲得研究對象的知情同意，本研究方案經青島大學醫(yī)學院倫理委員會審批通過。

二、研究方法

1.基因組DNA提取:取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)［天根生化科技(北京)有限公司］提取基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度，－20℃冰箱保存。

2.聚合酶鏈反應(PCR)法:以RUNX3基因組序列為依據(jù)，設計該基因rs2236852位點PCR引物，由Invitrogen公司提供。引物上游序列:5’-GAG GTG GCA GCC CTG CCA TA-3’，下游:5’-TGG AGT GGC TCC CCT CTT TCT G-3’，片段大小120 bp。PCR 反應體系為 25 μL，含 100 μg/L DNA 模板，10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，50 mmol/L MgCl20.8 μL，10 mmol/L dNTP 混合液0.5 μL，5 μmol/L 正反向引物各 1 μL，Platinum?Taq DNA 聚合酶(Invitrogen公司)0.2 μL，加入滅菌蒸餾水補足至25 μL。上ABI9700 PCR儀(美國 ABI公司)進行擴增反應，反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán);72℃終延伸5 min。取PCR產物2 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。

3.DNA直接測序分析基因型:確定目的片段擴增成功后，加入POP-6膠，應用ABI PRISMTM3700 DNA Analyzer進行測序。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)以百分率表示。基因型頻率先行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，組間比較采用χ2檢驗，rs2236852位點基因型與胃癌發(fā)病風險關系的分析采用Logistic回歸分析，計算OR值及其95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、一般資料

在研究期間納入的310例胃癌患者中，男206例，女104例，平均年齡(55.7±14.2)歲。327名對照者中，男219名，女108名，平均年齡(56.4±14.6)歲。兩組間性別構成(P=0.889)、年齡(P=0.891)、吸煙狀況(P=0.055)和飲酒狀況(P=0.627)相比差異均無統(tǒng)計學意義，說明樣本具有可比性。

二、rs2236852位點基因型

瓊脂糖凝膠電泳結果表明RUNX3基因rs2236852位點PCR擴增產物與目的片段大小一致，擴增成功。

對照組測序結果表明RUNX3 rs2236852基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明樣本具有群體代表性。該位點AA、GA、GG基因型測序結果見圖1。

三、RUNX3 rs2236852基因型與胃癌發(fā)病風險的關系

胃癌組與對照組的RUNX3 rs2236852基因型分布頻率相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與AA基因型相比，GG基因型能顯著增加胃癌的發(fā)病風險(OR=2.46，95%CI:1.60～3.78)，差異有統(tǒng)計學意義;AG基因型雖能提高胃癌的發(fā)病風險，但差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)(見表 1)。

圖1 RUNX3 rs2236852位點各基因型測序圖

表1 RUNX3基因rs2236852位點基因型與胃癌發(fā)病風險的關系

討 論

RUNX3位于染色體1p36.1，長約67 kb，含有 P1、P2兩個啟動子以及6個外顯子，編碼由415個氨基酸殘基組成的核心結合因子(core binding factors，CBFs)。RUNX3蛋白是由α、β兩個亞單位構成的異二聚體，α亞單位含有一段由128個氨基酸組成的高度保守域Runt結構域(runt domain，RD)，能特異性識別目的基因并與之結合［4］。RUNX3作為轉化生長因子(TGF)信號轉導通路中非常重要的調節(jié)因子，可與TGF途徑成員共同調控細胞的生長、發(fā)育和凋亡［5］。RUNX3基因遺傳變異與腫瘤的研究目前較少見。Zhang等［6］的研究發(fā)現(xiàn)RUNX3基因rs2236852位點GG基因型能顯著增加膀胱癌的發(fā)病風險。

RUNX3基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生關系的研究結論目前未取得統(tǒng)一。Hishida等［7］報道了 RUNX3基因外顯子 1 rs6672420位點和內含子rs760805位點T/A多態(tài)性與日本胃癌患者的關系，結果顯示幽門螺桿菌感染者中，與TT基因型相比，rs760805位點攜帶A等位基因(TA、AA、TA+AA基因型)可明顯促進胃萎縮的發(fā)生(調整OR值分別為1.51、1.59和1.53)，但兩個位點的多態(tài)性均與胃癌無明顯關系。胡勝等［8］的研究發(fā)現(xiàn)RUNX3基因C364T突變與胃癌發(fā)生無關。Keller等［9］的研究分析了RUNX3基因多態(tài)性與34例德國家族性胃癌患者(20例彌散型，9例腸化生型和5例混合型)遺傳傾向的關系，但未發(fā)現(xiàn)兩者相關。Wu等［10］對RUNX3 10個標簽SNPs與我國胃癌發(fā)生風險的關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)3個標簽SNPs的攜帶與胃癌風險增高有關，分別為SNP3 rs11249206 CC基因型(與TT基因型相比，調整OR=1.75，95%CI:1.03 ～ 2.99)、SNP7 rs760805 AA 基因型(與 TT 基因型相比，調整 OR=1.82，95%CI:1.14 ～2.92)、SPN8 rs2236852 GG基因型(與AA基因型相比，調整OR=1.69，95%CI:1.05 ～ 2.72)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組 RUNX3 rs2236852基因型分布頻率與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與AA基因型相比，GG基因型能顯著增加胃癌的發(fā)病風險(OR=2.46，95%CI:1.60 ～3.78);AG 基因型可增加胃癌發(fā)病風險，但差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)。

綜上所述，本研究結果初步顯示RUNX3基因rs2236852位點GG基因型可能與中國漢族人群的胃癌發(fā)病風險增加有關，但該結論尚需今后行更大樣本、設計更嚴格的多中心研究進一步驗證。

1 Crew KD，Neugut AI.Epidemiology of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):354-362.

2 Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World J Gastroenterol，2006，12(1):17-20.

3 謝英標主編.胃癌防與治［M］.西安:西安交通大學出版社，2010:9-11.

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5 Derynck R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression［J］.Nat Genet，2001，29(2):117-129.

6 Zhang Z，Wang S，Wang M，et al.Genetic variants in RUNX3 and risk of bladder cancer:a haplotype-based analysis［J］.Carcinogenesis，2008，29(10):1973-1978.

7 Hishida A，Matsuo K，Goto Y，et al.Significant association of RUNX3 T/A polymorphism at intron 3(rs760805)with the risk of gastric atrophy in Helicobacter pylori seropositive Japanese［J］. JGastroenterol， 2009， 44 (12):1165-1171.

8 胡勝，宋啟斌，柯玉華，等.RUNX3基因364位點C→T突變與胃癌關系的研究［J］.中國病理生理雜志，2005，21(10):1905-1908.

9 Keller G，Vogelsang H，Becker I，et al.Germline mutations of the E-cadherin(CDH1)and TP53 genes，rather than of RUNX3 and HPP1，contribute to genetic predisposition in German gastric cancer patients［J］.J Med Genet，2004，41(6):e89.

10 Wu D，Tian Y，Gong W，et al.Genetic variants in the Runt-related transcription factor 3 gene contribute to gastric cancer risk in a Chinese population［J］.Cancer Sci，2009，100(9):1688-1694.