徐銘益 賈小芳 張啟迪 李鄭紅 張清清 王興鵬 張麗軍 陸倫根#

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(200080) 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生中心蛋白組學(xué)平臺(tái)2

我國(guó)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高流行區(qū)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性率為9.09%［1］，現(xiàn)癥慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者超過(guò)3000萬(wàn)，每年新發(fā)患者100余萬(wàn)例，且發(fā)病日趨低齡化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CHB患者肝硬化失代償?shù)哪臧l(fā)生率約為3%，5年累計(jì)發(fā)生率約為16%［2］。肝組織炎癥活動(dòng)度是評(píng)價(jià)CHB病變的重要指標(biāo)。準(zhǔn)確評(píng)估肝組織炎癥程度對(duì)CHB的治療、藥物療效的評(píng)估以及預(yù)后干預(yù)均具有重要臨床意義。及時(shí)評(píng)估和動(dòng)態(tài)觀察肝組織病變程度的演變，亦是防治CHB發(fā)展為肝硬化和終末期肝病的關(guān)鍵。新技術(shù)多肽組學(xué)已應(yīng)用于篩查新的診斷標(biāo)記物，包括循環(huán)多肽篩檢多種疾病的診斷標(biāo)記物［3，4］。本研究通過(guò)采用血清多肽組學(xué)法，旨在篩選新的CHB非創(chuàng)傷性診斷炎癥分期的標(biāo)記物。

對(duì)象與方法

一、主要試劑和儀器

1.主要試劑:N，N－甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購(gòu)自美國(guó)USB公司;碘乙酰胺(IAA)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;色譜純乙腈、甲醇(MeOH)購(gòu)自美國(guó)Merck公司;甲酸購(gòu)自美國(guó)Fluka公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2.主要儀器:離心濃縮儀購(gòu)自美國(guó)Labconco公司;納升級(jí)液相色譜Ultimate 3000以及C18預(yù)柱和C18反相色譜柱購(gòu)自美國(guó)戴安公司;HCT離子阱質(zhì)譜購(gòu)自德國(guó)布魯克儀器有限公司;LC－20AD型高效液相色譜儀購(gòu)自日本島津公司;三重四極桿質(zhì)譜儀API 3200TM LC/MS/MS系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司;C18固相萃取柱購(gòu)自 Waters公司;Ultracel YM－10(分子質(zhì)量截流值10 kDa，1 Da=0.9921 u)購(gòu)自Millipore公司。

二、臨床隊(duì)列建立

建立前瞻性臨床隊(duì)列，共146例入選，其中126例為2008年1月～2010年12月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院確診的CHB病例。CHB病例入選標(biāo)準(zhǔn):按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的“慢性乙型肝炎防治指南”［1］所規(guī)定的慢性 HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn);排除條件:艾滋病毒或慢性丙型肝炎病毒感染，酒精攝入量＞30 g/d，代謝性或其他類型的肝損，或已接受肝病治療，肝活檢組織不符合標(biāo)準(zhǔn)者。入選對(duì)象均于肝穿刺前一周內(nèi)取清晨空腹靜脈血。行血常規(guī)、生化、乙肝二對(duì)半定量、HBV－DNA檢測(cè)，并留取血清標(biāo)本－80℃保存。入選的CHB病例均行經(jīng)皮肝活檢病理學(xué)檢查，肝臟炎癥程度診斷參照Scheuer標(biāo)準(zhǔn)分期(G0～G4期)。另選取同期本院20名體檢人群的血清標(biāo)本作為健康對(duì)照組。所有入組患者均獲得知情同意，本研究方案通過(guò)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

三、血清多肽提取

取50 μL 血清樣本，加入 100 μL 沉淀劑(含0.1%甲酸的乙腈)，4℃孵育30 min，12 000 r/min離心后取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀凍干，－20℃保存待用。提取出的血清多肽標(biāo)本以離心濃縮儀凍干后，采用20 μL 上樣緩沖液(12%SDS，6% β－巰基乙醇，30%甘油，150 mmol/L Tris－HCl，pH=7.0)進(jìn)行復(fù)溶，通過(guò) Tricine－SDS－PAGE 電泳(4%濃縮膠、10%間層膠和16%分離膠)分離檢測(cè)。

四、液相色譜法聯(lián)合質(zhì)譜法(LC－MS/MS)

多肽樣品以50 μL上樣緩沖液溶解，然后采用10 000 Da的超濾管超濾，濾液直接上樣納升級(jí)液相色譜串聯(lián)高容量離子阱質(zhì)譜HCT進(jìn)行分析，樣品先經(jīng)直徑5 μm的 C18預(yù)柱脫鹽，流速為20 μL/min，流動(dòng)相為2%色譜純乙腈和0.1%甲酸。然后以300 nL/min的流速經(jīng)填料粒徑為3 μm的C18反向分析柱進(jìn)行分離，分離流動(dòng)相溶液A為含0.1%甲酸的2%乙腈水溶液;溶液B為含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液。洗脫條件:0～10 min，4%B，10～70 min，4% ～60%B;70～80 min，90%B;80～100 min，40%B。通過(guò)C18色譜柱分離的肽段由納流噴針進(jìn)入HCT質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)離子化分析檢測(cè)。流經(jīng)分析柱的色譜流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的純凈水，B液為0.1%甲酸和80%乙腈。質(zhì)譜設(shè)定為m/z范圍100～2800，時(shí)間范圍600～4500 s。所用樣品均分析三次，兩次MS掃描用于差異分析，一次Auto MS(n)掃描用于多肽鑒定。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，采用ES TunMix校正儀器。

一級(jí)MS數(shù)據(jù)尋找差異峰:獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)ProfileAnalysis軟件(Bruker Daltonics)分析。設(shè)定分子質(zhì)量和出峰時(shí)間的誤差分別為1 Da和60 s，找出兩類樣品間差異峰，差異峰需同時(shí)滿足P＜0.05，m/z＞300，retention time＞10 min(脫鹽時(shí)間)，差異倍數(shù)＞1.5倍，至少在80%的樣品中檢出該差異峰。所有二級(jí)MS/MS數(shù)據(jù)計(jì)算峰強(qiáng)度積分(scored peak intensity，SPI)值。多肽峰質(zhì)譜儀離子源產(chǎn)生+2價(jià)、肽段得分＞10分的離子或離子源產(chǎn)生+1價(jià)或+3價(jià)、肽段得分 ＞13分的離子，同時(shí)SPI值＞70視作有效峰。

差異多肽峰的確認(rèn):Auto MS(n)數(shù)據(jù)經(jīng)DataAnalysis軟件分析后，生成MGF文件，用Mascot軟件檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行多肽鑒定。搜庫(kù)參數(shù):一級(jí)質(zhì)譜MS的誤差為±1.2 Da，二級(jí)質(zhì)譜MS/MS的誤差為±0.6 Da;可變修飾為甲硫氨酸氧化;質(zhì)譜儀離子源產(chǎn)生+1、+2、+3價(jià)的離子;質(zhì)譜數(shù)據(jù)模式為單同位素峰。肽段得分＞15分的多肽經(jīng)人工檢查去除假陽(yáng)性結(jié)果后，認(rèn)為鑒定可靠。

筆者等［5］的前期研究已證實(shí)差異多肽片段m/z 520.3可用于診斷肝纖維化，故選取該片段行后續(xù)研究。

五、多肽m/z 520.3的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)

采用島津高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜API 3200TMLC/MS/MS系統(tǒng)行MRM分析。血清多肽標(biāo)本置入含2%乙腈、0.1%甲酸的50 μL液體中，4℃ 12 000 r/min離心30 min取上清。使用戴安1.0 mm×150 mm 300 ? C18色譜柱，流速為0.06 mL/min。液相色譜梯度和流動(dòng)相參數(shù)為:①0～12 min，4% ～45%乙腈，0.1%甲酸流動(dòng)相;②12～20 min，45%乙腈，0.1%甲酸流動(dòng)相;③20～25 min，80%乙腈，0.1%甲酸流動(dòng)相;④25～50 min，4%乙腈，0.1%甲酸流動(dòng)相。API 3200質(zhì)譜儀基本參數(shù):MRM mode;IS:5500;CAD:60;DP:50;EP:8;CE:35。多肽m/z 520.3行4個(gè)離子對(duì)掃描，分析軟件捕獲每個(gè)目標(biāo)肽的產(chǎn)物離子對(duì)和離子對(duì)的峰面積積分值，同時(shí)計(jì)算差異肽的產(chǎn)物離子對(duì)和內(nèi)參肽離子對(duì)的累積峰面積，最終得到累積峰面積比值(summed peak areas ratio，SPAR)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、前瞻性臨床隊(duì)列的建立

40例CHB病例血清標(biāo)本用于LC－MS/MS法，分為輕度炎癥組(G0期10例，G1期10例)和重度炎癥組(G3期10例，G4期10例)。20名對(duì)照組和86例CHB病例(G0期13例，G1期22例，G2期20例，G3期16例，G4期15例)血清標(biāo)本用于MRM檢測(cè)。所有入選者的臨床資料見(jiàn)表1。

二、LC－MS/MS 法

LC－MS/MS法篩檢出輕度與重度炎癥組血清之間共存在936個(gè)差異多肽峰。ProfileAnalysis軟件計(jì)算差異多肽峰的SPI值顯示，9個(gè)多肽峰的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與重度炎癥組相比，輕度炎癥組7個(gè)多肽分子峰強(qiáng)度上調(diào)表達(dá)，2個(gè)多肽分子下調(diào)表達(dá)(見(jiàn)表2)。

表1 隊(duì)列的臨床資料

表2 輕度與重度炎癥CHB患者血清顯著差異多肽分子

三、MRM分析

多肽m/z 520.3的結(jié)構(gòu)LLSKLSVLLLEKMG+Oxidation(M)，IP號(hào)100551024，分子生物信息學(xué)驗(yàn)證其蛋白名為二羥丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，DAK)。多肽分子m/z 520.3可產(chǎn)生4個(gè)離子對(duì)，其SPAR值與HBeAg陽(yáng)性和HBV－DNA無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)圖1A、1B)，但隨著肝炎癥程度(G0～G4期)的加重而呈不同程度的下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖1C)。說(shuō)明血清m/z 520.3肽離子水平與肝臟炎癥程度負(fù)相關(guān)。

四、診斷炎癥程度的AUROC評(píng)估

多肽離子對(duì) 520.3/176.1、520.3/353.7、520.3/459.8、520.3/503.3區(qū)分CHB炎癥G2～G4期與G0～G1期的 AUROC 值分別為 0.840、0.843、0.694、0.856(見(jiàn)圖2A)，區(qū)分G3～G4期與G0～G2期的AUROC值分別為0.886、0.790、0.731、0.888(見(jiàn)圖2B)。

圖1 多肽m/z 520.3的4個(gè)離子對(duì)SPAR定量值箱圖

圖2 多肽m/z 520.3的離子對(duì)診斷CHB炎癥分期的AUROC圖

討 論

通過(guò)肝活檢標(biāo)本行組織學(xué)檢查一直是明確肝病病因、評(píng)估肝臟炎癥、壞死和脂肪變性程度的金標(biāo)準(zhǔn)。目前針對(duì)慢性肝炎肝組織炎癥的非創(chuàng)傷性診斷研究很少，其中具有代表性的血清 ActiTest診斷模型［6，7］是針對(duì)慢性丙型肝炎而建立的，符合我國(guó)國(guó)情的CHB肝組織炎癥非創(chuàng)傷性預(yù)測(cè)模型仍缺乏。

血清多肽組學(xué)具有創(chuàng)新性，已應(yīng)用于篩查腫瘤等疾病的診斷標(biāo)記物，但尚未涉及肝病診斷。本研究首次采用LC－MS/MS聯(lián)合MRM的多肽組學(xué)技術(shù)篩查CHB肝臟炎癥診斷的血清標(biāo)記物。已有前期研究［5］證實(shí)DAK多肽m/z 520.3與肝纖維化分期高度關(guān)聯(lián)，且具診斷效力。本研究采用LC－MS/MS法篩選顯示，輕度與重度肝臟炎癥組間存在9個(gè)差異多肽，其中包括多肽m/z 520.3。進(jìn)一步MRM定量研究發(fā)現(xiàn)，血清m/z 520.3解離的4個(gè)離子對(duì)的SPAR值與肝臟炎癥程度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，離子對(duì)520.3/176.1和520.3/503.3對(duì)肝臟炎癥程度具有較好的診斷效力(AUROC范圍0.840～0.888)。

傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)ELISA和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)血清DAK蛋白的敏感性不高，因此一直未發(fā)現(xiàn)其與肝臟炎癥或纖維化的相關(guān)性。生物信息學(xué)證實(shí)分子多肽m/z 520.3是DAK的肽片段。DAK具有雙向ATP依賴性，人肝臟DAK蛋白結(jié)構(gòu)特性和功能在2005年首次被確認(rèn)［8］。此外，DAK是特異性抑制MDA5介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵酶之一［9］。Perdomo等［10］的研究發(fā)現(xiàn)包括 DAK 在內(nèi)的5個(gè)標(biāo)記物與丙型肝炎患者預(yù)后相關(guān)，其判斷藥物治療應(yīng)答與否的準(zhǔn)確率高達(dá)85.7%。上述研究結(jié)果提示DAK與慢性肝炎的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但具體作用機(jī)制有待闡明。

血清蛋白多肽組學(xué)技術(shù)起步較晚，但其用于篩查診斷分子蛋白的敏感性明顯優(yōu)于血清抗體ELISA檢測(cè)技術(shù)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)血清DAK多肽分子m/z 520.3可作為CHB肝臟炎癥分期的診斷標(biāo)記物，具有廣闊的應(yīng)用前景，但其在CHB人群中的診斷價(jià)值還需行大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(12):881－901.

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