張海燕 劉忠錦 馮化杰 廉 潔 陳志偉 黃 健

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默病是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為細(xì)胞外老年斑中β淀粉樣蛋白的沉積、細(xì)胞內(nèi)由成對(duì)的過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1]，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多種治療方法目前正在探索中[2]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTFs）與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切關(guān)系。而膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家庭中的一名新成員。關(guān)于電針治療AD大鼠海馬GDNF表達(dá)的方面比較少，本研究主要觀察電針對(duì)AD大鼠海馬PKC和GDNF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組

清潔級(jí)健康Wistar大鼠45只，雄性，體重200～250 g，白求恩醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2010002，經(jīng)水迷宮測(cè)試篩選40只，隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、西藥組和電針組，正常組常規(guī)飲水和飼料。其余3組大鼠均采用鏈脲霉素（STZ）所致AD模型，模型組造模后不治療。參照華興邦等[3]的大鼠穴位圖譜，電針組針刺雙腎俞（第二腰椎棘突下左、右側(cè)旁開7 mm）、雙足三里（腓骨小頭下約5 mm處）、百會(huì)（頂骨正中）、大椎（第七頸椎與第一胸椎間）[4]等穴治療，用 0.25×0.25 mm華佗牌無菌毫針針刺，連接KWD-808全能脈沖電療儀，電壓為2 V，頻率為30 Hz，，強(qiáng)度以肢體局部輕微顫動(dòng)為適。西藥組采用氫溴酸加蘭他敏灌胃 0.5～1.0 mg/（kg·d），治療 4 周。

1.2 主要試劑和儀器

氫溴酸加蘭他敏，鏈脲霉素STZ（注射前將STZ溶于0.9%氯化鈉溶液）。PKC免疫組化檢測(cè)試劑盒（博士德生物工程有限公司），GDNF免疫組化檢測(cè)試劑盒 （博士德生物工程有限公司），腦立體定位儀，水迷宮，Hans電針儀，Olympus顯微鏡。

1.3 模型復(fù)制

10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，在頭部做正中矢狀切口，坐標(biāo)為腦表面下3.5 mm，前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm。在每側(cè)側(cè)腦室注射10%鏈脲霉素10 μL，創(chuàng)口縫合。3 d后重復(fù)注射一次。

1.4 各組大鼠標(biāo)本的制備

大鼠治療4周后，麻醉后暴露出心臟，左心室插入灌注針頭，快速灌入無菌生理鹽水沖洗組織內(nèi)血液，同時(shí)剪開右心耳，沖洗至肝臟變白，然后灌注4%多聚甲醛，當(dāng)大鼠尾巴、四肢僵硬時(shí)斷頭取腦，分離海馬[5]。一側(cè)海馬裝入凍存管，一側(cè)置于4%多聚甲醛中，浸泡固定，取海馬標(biāo)本，脫水包埋切片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色大鼠海馬PKC和GDNF

PKC、GDNF免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀顆粒，主要分布在胞漿。采集免疫組化染色圖像，用Imagepro-Plus分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片區(qū)6個(gè)視野測(cè)定海馬組織中陽性細(xì)胞數(shù)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0系統(tǒng)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

正常組、模型組PKC和GDNF蛋白有較高表達(dá)，模型組PKC和GDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低，治療后西藥組、電針組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 電針對(duì)海馬PKC和 GDNF表達(dá)的影響（±s，n=10）

表1 電針對(duì)海馬PKC和 GDNF表達(dá)的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05

組別 海馬PKC陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）海馬GDNF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/高倍視野）正常組模型組西藥組電針組32.17±13.52＊16.26±3.58 28.34±10.68＊27.49±11.71＊96.31±8.94＊72.38±6.15 88.62±7.49＊86.73±7.65＊

3 討論

PKC是一類由多種同工酶組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，PKC參與學(xué)習(xí)記憶與影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) （longterm potentiation，LTP）的形成有關(guān)，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)PKC的激活參與了離子通道的調(diào)節(jié)、受體的失敏、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸傳遞。PKC的激活是突觸可塑性及LTP形成的分子機(jī)制之一。Cordey M等[6]研究證明經(jīng)典的PKC亞型能夠阻止Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。唐勇等[7]電針治療AD大鼠后發(fā)現(xiàn)，海馬PKC和酪氨酸蛋白激酶的活性發(fā)生變化，電針治療可能激活蛋白激酶信號(hào)通路，從而提高老年癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。星形膠質(zhì)細(xì)胞能釋放膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等大量的活性物質(zhì)，可以防止神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和神經(jīng)生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)[8]電針治療后的AD大鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)也顯著增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組大鼠海馬PKC、GDNF表達(dá)降低，經(jīng)治療后電針組表達(dá)增加 （P＜0.05）。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為老年性癡呆是由于陰陽、氣血、臟腑功能失調(diào)所引起的虛實(shí)夾雜的疾病，電針具有促進(jìn)氣血運(yùn)行，疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)平衡的特點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)顯示，電針刺激可激活PKC阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而使膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)GDHF mRNA。對(duì)AD大鼠海馬GDNF mRNA表達(dá)有正向調(diào)節(jié)作用?？梢妼?duì)損壞的海馬神經(jīng)元有修復(fù)作用，使AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效地防治老年性癡呆的作用機(jī)制。

[1]朱曉冬，蔣希成，毛翔.針刺對(duì)D-半乳糖復(fù)制阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中 β-AP、Tau 蛋白表達(dá)的影響[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，26（8）：158-159.

[2]邱文興，賈博宇，劉永武，等.通天草提取物對(duì) Aβ1-40所致 AD大鼠血清與海馬組織中細(xì)胞因子含量的影響[J].中醫(yī)藥信息，2012，29（2）：24-25.

[3]華興幫，周浩良.大白鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991，（1）：1-5.

[4]沈峰，杜艷軍，孫國(guó)杰，等.電針對(duì)Aβ25～35所致AD模型大鼠海馬 cAMP 的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7（2）：117-119.

[5]Xiao-Ping WANG，Hong-Liu DING.Alzheimer's disease： epidemiology，genetics，and beyond[J].Neurosci Bull，April，2008，24（2）：105-109.

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[7]唐勇，余曙光，劉旭光，等.電針激活老年癡呆大鼠海馬蛋白激酶信號(hào)通路的作用[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（1）：124-125.

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