張 浩，盧衛(wèi)紅 ，張宸閣，李泳財(cái)

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090;2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東廣州510000;3.中糧集團(tuán)有限公司，北京100020)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人體接觸空間電離輻射的機(jī)會(huì)不斷增加。電離輻射線既可以直接攻擊生物體內(nèi)各種生物大分子，從而直接殺傷細(xì)胞造成急性輻射損傷，又可以間接激發(fā)體內(nèi)水分子，從而產(chǎn)生大量具有強(qiáng)氧化性的活潑自由基造成危害［1］。無論是何種損傷，均可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫功能紊亂［2］，長(zhǎng)期或大量的空間電離輻射還會(huì)引起機(jī)體的免疫功能障礙，輕者導(dǎo)致免疫功能長(zhǎng)期低下，重者常因合并全身嚴(yán)重感染而死亡［3］。同時(shí)電離輻射線還能攻擊造血系統(tǒng)，導(dǎo)致貧血、出血等并發(fā)癥［4］。天然產(chǎn)物中的防輻射活性成分(包括黃酮類、多酚類、多糖類等)，能對(duì)電離輻射產(chǎn)生有效地防護(hù)作用［5］，越來越受到人們的關(guān)注。玉米花粉是我國(guó)產(chǎn)量最多的蜂花粉，其具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫等醫(yī)療保健功能［6］，黃酮類化合物是玉米花粉中最主要的天然活性成分，其在玉米花粉的保健功效中發(fā)揮著重要作用。本研究探討了玉米花粉黃酮類化合物對(duì)模擬空間輻照所致哺乳動(dòng)物損傷的防護(hù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)利用玉米花粉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米花粉 采集自吉林省蛟河市昌云蜜蜂園;昆明種小鼠 50只，6～10周齡，體重18～22g，均為雄性，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;SOD、GSH-Px、MDA及考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒 購自南京建成生物工程研究所;AB-8大孔樹脂 購自安徽三星樹脂科技公司;蘆丁片 購自臨汾寶珠制藥有限公司。

CLINAC21 EX醫(yī)用電子直線加速器 VARIAN公司，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院提供;KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FD-18型真空冷凍 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米花粉黃酮提取物的制備 玉米花粉干燥粉末用20倍70%乙醇于45℃水浴下超聲輔助提取2h，過濾，取濾液，濾渣再重復(fù)提取2次，棄濾渣，合并3次提取的濾液，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，真空冷凍干燥，得到黃酮粗提取物。

黃酮粗提物經(jīng)甲醇復(fù)溶除雜，以適量蒸餾水加溫溶解，采用濕法上樣進(jìn)行AB-8大孔樹脂柱分離純化，分別以4倍柱體積蒸餾水、20%、40%、60%、80%和95%乙醇6個(gè)梯度的洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集得到的各梯度洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得到6種玉米花粉黃酮提取物。以體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)［7］，選取40%、95%乙醇洗脫組分進(jìn)行體內(nèi)免疫系統(tǒng)輻射防護(hù)分析，兩組份分別命名為FMP-1及FMP-2。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓把?、組織勻漿的制備

將小鼠隨機(jī)分為FMP-1給藥組、FMP-2給藥組、蘆丁陽性組、空白對(duì)照組、輻照對(duì)照組，每組10只。對(duì)FMP-1、FMP-2組、蘆丁組小鼠分別進(jìn)行對(duì)應(yīng)劑量藥品灌胃，各組灌胃劑量依次為78、54、78mg/kg/d，空白對(duì)照組、輻照對(duì)照組以10mL/kg/d劑量灌服蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃21d，第21d灌胃后，除空白對(duì)照組外各組均通過醫(yī)用電子直線加速器進(jìn)行4.0Gy劑量模擬空間輻照，劑量率為1.00Gy/min，照射野為50cm×50cm，皮源距為100cm，輻照24h后采用眼球取血法采集血液，頸椎脫臼法處死小鼠。

血液樣品收集于EDTA-Na2采血管中，靜置放入4℃冰箱中冷藏12h，5000r/min低溫離心10min，取上清于凍存管中冷藏備用。

處死之后，立即取出小鼠肝臟、脾臟組織，在0.86%(w/v)預(yù)冷的生理鹽水中清洗凈血污，濾紙吸去多余水分，稱重。取適量組織置于研缽中，注入少許液氮快速研磨，待組織充分勻漿化后向研缽中加入一定體積0.86%預(yù)冷生理鹽水，充分混合后轉(zhuǎn)移至離心管，補(bǔ)充生理鹽水至加入生理鹽水的總體積為肝臟自身重量的9倍，制備成10%的肝組織勻漿。利用離心機(jī)以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄沉淀取上清備用。

1.2.3 肝脾組織勻漿蛋白含量的測(cè)定 肝臟、脾臟組織勻漿蛋白含量通過考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

1.2.4 肝脾指數(shù)測(cè)定 肝(脾)指數(shù)=1000×肝(脾)重/體重。

1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所研制的SOD測(cè)定試劑盒進(jìn)行SOD活力的測(cè)定。

1.2.6 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所研制的GSH-Px測(cè)定試劑盒進(jìn)行GSH-Px活力的測(cè)定。

1.2.7 脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所研制的MDA測(cè)定試劑盒進(jìn)行MDA含量的測(cè)定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠肝脾指數(shù)的影響

肝脾指數(shù)作為典型的臟器指數(shù)，可在一定程度上反應(yīng)機(jī)體受損情況［8］，且脾臟作為人體最大的免疫器官，其指數(shù)變化能直觀顯著的反應(yīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)狀況。各組肝脾指數(shù)情況如表1所示。

表1 各組肝脾指數(shù)統(tǒng)計(jì)表(±s)Table 1The tables of liver and spleen index(±s)

表1 各組肝脾指數(shù)統(tǒng)計(jì)表(±s)Table 1The tables of liver and spleen index(±s)

注:Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01 與空白對(duì)照組比較;*p＜0.05，＊＊p＜0.01與輻照對(duì)照組比較。表2～表4同。

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由表1可見，同空白對(duì)照組相比，輻照對(duì)照組肝脾指數(shù)均有所下降，且脾指數(shù)呈現(xiàn)極顯著性下降(p＜0.01)，說明模擬空間輻照對(duì)小鼠肝臟造成了一定損傷，且能引起小鼠脾臟不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重萎縮，同時(shí)，此結(jié)果從側(cè)面說明以脾臟為首的免疫器官極易受到輻照射線的傷害。

同輻照對(duì)照組相比，蘆丁陽性對(duì)照組、FMP-1、FMP-2給藥組肝脾指數(shù)均有所上升，說明玉米花粉黃酮提取物能有效減輕輻射對(duì)小鼠肝臟和脾臟的傷害。同時(shí)，與輻照對(duì)照組相比，F(xiàn)MP-1給藥組肝脾指數(shù)均表現(xiàn)出顯著性差異(p＜0.05)，且同蘆丁陽性對(duì)照組相比也有明顯提高，說明玉米花粉黃酮40%乙醇洗脫物對(duì)輻照小鼠肝脾損傷防護(hù)作用更佳，且相同劑量情況下其防護(hù)效果優(yōu)于市售蘆丁片制劑。

表2 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠SOD活力的影響(±s)Table 2Effect of corn pollen flavonoids on SOD activity of irradiated mice(±s)

表2 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠SOD活力的影響(±s)Table 2Effect of corn pollen flavonoids on SOD activity of irradiated mice(±s)

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表3 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠GSH-Px活力的影響(±s)Table 3Effect of corn pollen flavonoids on GSH-Px activity of irradiated mice(±s)

表3 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠GSH-Px活力的影響(±s)Table 3Effect of corn pollen flavonoids on GSH-Px activity of irradiated mice(±s)

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2.2 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠SOD活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)可催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，是清除超氧陰離子自由基的特異性抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，具有保護(hù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體H2O2濃度的生理功能［9］。各組小鼠SOD活力情況如表2所示。

由表2可見，同空白對(duì)照組相比，輻照對(duì)照組各組織中SOD活力顯著下降(p＜0.05)，尤其血清中SOD活力顯示極顯著性差異(p＜0.01)，說明模擬空間輻照對(duì)小鼠組織造成了較大的危害，同時(shí)說明，同肝脾組織相比，血液系統(tǒng)更易受到輻射射線的傷害。

同輻照對(duì)照組相比，蘆丁陽性對(duì)照組、FMP-1、FMP-2給藥組血清、肝臟、脾臟中SOD活力均有所提高，說明玉米花粉黃酮提取物能較好的保護(hù)機(jī)體中的超氧化物歧化酶。其中，F(xiàn)MP-1及FMP-2組血清、肝臟、脾臟SOD活力均顯著高于輻照對(duì)照組(p＜0.05)，同時(shí)，同蘆丁陽性對(duì)照組相比，F(xiàn)MP-1、FMP-2組血清、肝臟、脾臟SOD活力也有所提高。結(jié)果說明:玉米花粉黃酮40%及95%乙醇洗脫物均對(duì)輻照小鼠機(jī)體內(nèi)超氧化物歧化酶具有顯著的保護(hù)作用，相同劑量情況下其防護(hù)效果優(yōu)于市售蘆丁片制劑。

2.3 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠GSH－Px活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，它特異的催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，機(jī)體內(nèi)的GSH-Px具有清除有機(jī)氫過氧化物及替代過氧化氫酶清除H2O2的生物學(xué)意義［10］。各組小鼠 GSH-Px活力情況如表3所示。

由表3可見，空間模擬輻照對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px活力影響不大，對(duì)脾臟中GSH-Px影響較為顯著(p＜0.05)，對(duì)血清的影響極為顯著(p＜0.01)，說明模擬空間輻照對(duì)小鼠脾臟及血液系統(tǒng)造成了較大的危害，同時(shí)，此結(jié)論與 Wright E G，Enik? Noémi Bogdándi等研究結(jié)果相符［11-12］，說明血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)是機(jī)體輻射最敏感系統(tǒng)。

同輻照對(duì)照組相比，蘆丁陽性對(duì)照組、FMP-1、FMP-2給藥組血清、肝臟、脾臟中GSH-Px活力均有所提高，說明玉米花粉黃酮提取物能較好的保護(hù)機(jī)體中的谷胱甘肽過氧化物酶活性。FMP-1血清及FMP-1、FMP-2組脾臟中GSH-Px活力均顯著高于輻照對(duì)照組(p＜0.05);且與輻照對(duì)照組相比，F(xiàn)MP-1給藥組肝臟、FMP-2給藥組血清中GSH-Px活力均表現(xiàn)出極顯著性差異(p＜0.01);同時(shí)同蘆丁陽性對(duì)照組相比，F(xiàn)MP-1、FMP-2組血清、脾臟GSH-Px活力也有所提高。結(jié)果說明:玉米花粉黃酮40%及95%乙醇洗脫物均對(duì)輻照小鼠機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶具有顯著的保護(hù)作用，相同劑量情況下其防護(hù)效果優(yōu)于市售蘆丁片制劑。

2.4 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠MDA含量的影響

機(jī)體中的自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生如醛基(丙二醛MDA)、酮基、氫過氧基等脂質(zhì)過氧化物，從而造成細(xì)胞損傷。因而機(jī)體MDA水平的高低常可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度［13］。各組小鼠MDA含量情況如表4所示。

由表4可見，空間模擬輻照能顯著促進(jìn)小鼠肝脾細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(p＜0.05)，提高其組織中MDA含量，且對(duì)小鼠血液系統(tǒng)能造成極顯著性性損傷(p＜0.01)，說明模擬空間輻照對(duì)小鼠血液及肝脾組織中的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有促進(jìn)作用，能顯著性的損傷小鼠各組織生物膜，同時(shí)，也進(jìn)一步說明同肝脾組織相比，血液系統(tǒng)更易受到輻射射線的傷害。

表4 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠MDA含量的影響(±s)Table 4Effect of corn pollen flavonoids on MDA level of irradiated mice(±s)

表4 玉米花粉黃酮提取物對(duì)輻射小鼠MDA含量的影響(±s)Table 4Effect of corn pollen flavonoids on MDA level of irradiated mice(±s)

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同輻照對(duì)照組相比，蘆丁陽性對(duì)照組、FMP-1、FMP-2對(duì)照組血清、肝臟、脾臟中MDA含量均有所降低，說明玉米花粉黃酮提取物能較好的抑制機(jī)體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)小鼠機(jī)體起到一定的保護(hù)作用。FMP-1給藥組血清、肝臟、脾臟中MDA含量均顯著低于輻照對(duì)照組(p＜0.05);FMP-2給藥組肝臟、脾臟中MDA含量均顯著低于輻照對(duì)照組(p＜0.05)，且脾臟中 MDA含量差異性極為顯著(p＜0.01);同時(shí)，同蘆丁陽性對(duì)照組相比，F(xiàn)MP-1、FMP-2組肝臟、脾臟MDA含量均有所下降。結(jié)果說明玉米花粉黃酮40%及95%乙醇洗脫物均能有效抑制輻照小鼠機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且相同劑量情況下其抑制效果優(yōu)于市售蘆丁片制劑。

3 結(jié)論

空間電離輻射可對(duì)生物體造成一系列嚴(yán)重的危害，如引起分子化學(xué)鍵斷裂，導(dǎo)致組織細(xì)胞變性、壞死等。玉米花粉中富含的的黃酮類化合物具有較好的輻射防護(hù)作用，能顯著提高機(jī)體肝脾指數(shù)，同時(shí)對(duì)機(jī)體血清及肝脾中抗氧化物酶類(如SOD、GSH-Px等)也具有較好的保護(hù)作用，且對(duì)機(jī)體組織中的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)也具有一定的抑制作用。結(jié)合前人研究，推測(cè)玉米花粉中黃酮類化合物對(duì)空間電離輻射的防護(hù)作用主要表現(xiàn)在血液及免疫系統(tǒng)［14］，其防護(hù)效果優(yōu)于相同劑量情況下的市售蘆丁片制劑，即說明玉米花粉黃酮是一類前景廣闊的天然輻射防護(hù)劑。

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