詹 萍，張曉鳴 ，田洪磊

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122;2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

隨著我國肉類食品工業(yè)的發(fā)展，人們對肉類食品的色、香、味提出較高的要求，尋求綠色食品已成為時(shí)代的潮流，這就需要各種更安全、更天然的肉味香精制成的調(diào)味劑來豐富和滿足人們的生活［1］。以植物蛋白和動(dòng)物蛋白為原料，采用酶法水解制備的具有呈味特性的游離氨基酸和短肽類物質(zhì)，通過Maillard反應(yīng)制備的肉味香精，無論從原料還是反應(yīng)過程中均可被視為天然產(chǎn)品，近年來已經(jīng)成為天然香精的一大發(fā)展趨勢［2］。然而，研究發(fā)現(xiàn)基于純氨基酸混合物和植物水解蛋白制備的肉味香精僅能部分模擬逼真的天然肉類風(fēng)味，產(chǎn)生的肉味不夠逼真［3］。雖然采用動(dòng)物蛋白可以很好的解決此類問題，但經(jīng)濟(jì)成本也隨之增高。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，骨骼中所含的蛋白質(zhì)與肉類較為接近，其所含氨基酸的種類和含量也與肉類相似，采用骨骼蛋白代替肉類蛋白進(jìn)行熱反應(yīng)香精的制備完全可行。本實(shí)驗(yàn)以提升我國羊肉加工副產(chǎn)物(羊骨、羊尾油、肚油)的綜合加工利用程度為目標(biāo)，以天然羊骨資源為主要原料，適度的對其進(jìn)行酶解，添加適量定向調(diào)控的羊脂，借助于現(xiàn)代生物技術(shù)、香精調(diào)配技術(shù)和食品加工技術(shù)等手段，以期研究開發(fā)出高品質(zhì)的肉味香精。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羊骨粉 選取新鮮的羊骨，處理后經(jīng)0.1MPa高壓蒸煮3～4h，將軟化后的羊骨去掉骨髓并進(jìn)行脫脂，然后放入烘箱50～60℃烘制4～6h，用粉碎機(jī)粉碎成骨粉，備用;大豆分離蛋白(867g/kg蛋白質(zhì))購自上海滬峰生物技術(shù)有限公司;羊油 天津天源油脂有限公司;堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、L-半胱氨酸、L-丙氨酸、硫胺素(VB1)、牛磺酸 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其它實(shí)驗(yàn)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

表1 雙酶酶解制備不同羊骨蛋白酶解液條件Table 1 The hydrolysis conditions of different SBHs by alcalase and flavourzyme

高溫循環(huán)器GX-2005 上海比朗儀器有限公司;離心機(jī)GL-20B 上海安亭科學(xué)儀器廠;美拉德高壓反應(yīng)瓶 上海有機(jī)化學(xué)研究所定制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊骨蛋白酶解液的制備 準(zhǔn)確稱取適量的骨粉，加入100mL蒸餾水，混勻后置于95℃水浴條件下加熱10min。降溫至55℃后，調(diào)節(jié)pH至8.5，依據(jù)前期所建立的回歸模型［4］采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶依次分步酶解制備不同水解度的羊骨蛋白酶解液，酶解完畢，于90～95℃滅酶 10min，降溫，離心后取上清液待用。不同水解度羊骨酶解液的制備條件如表1所示。

1.2.2 羊脂的氧化 在裝有水銀溫度計(jì)、冷凝回流管及導(dǎo)氣管的250mL四口燒瓶中加入100g羊脂，加熱使其熔化，用磁力攪拌器緩慢攪拌。當(dāng)羊油的溫度達(dá)到130℃時(shí)，開啟氣泵通入空氣氧化2h，空氣流速為60L/(h·100g脂肪)，反應(yīng)結(jié)束后測定該氧化羊脂的PV、AV和P-AV分別為316.23meq/kg·羊脂、1.43mgKOH/g、125.68。

1.2.3 HVP的制備 將大豆分離蛋白按固液比1∶8(W/V)加入蒸餾水，混勻后于85℃水浴中熱變性處理20min。降溫至60℃后，調(diào)節(jié)pH至8.0，添加5g/kg堿性蛋白酶，恒溫酶解4h后，將溫度調(diào)至50℃，pH調(diào)至6.5，加入4g/kg風(fēng)味蛋白酶，酶解4h后，升溫至90℃滅酶 10min，冷卻離心(3500r/min)30min，取上清液噴霧干燥，密封保存?zhèn)溆茫来藯l件下制得的大豆水解蛋白水解度為15.89%。

1.2.4 Maillard反應(yīng)羊肉香精的制備(MPF)肉品風(fēng)味的模擬較為復(fù)雜，添加不同的原料或當(dāng)改變Maillard反應(yīng)的條件，最終產(chǎn)品的風(fēng)味都會(huì)產(chǎn)生顯著的差異［5］。在進(jìn)行大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以羊骨蛋白酶解液(100.0g)為底物，添加不同比例的L-半胱氨酸、丙氨酸、?；撬?、硫胺素、葡萄糖、HVP、氧化羊脂為反應(yīng)基料，同時(shí)考慮Maillard反應(yīng)溫度、時(shí)間和體系初始pH等條件，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)［6］，共進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均進(jìn)行3次平行感官分析，因素水平見表2。

表2 Maillard反應(yīng)制備羊肉香精均勻設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 The factors and levels of uniform designs of Maillard reaction

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 常規(guī)指標(biāo)測定 水解度 DH(%)［7］:DH(%)=水解液中總游離氨基酸含氮量/總氮量×100;蛋白質(zhì)［8］:微量凱氏定氮法。

1.3.2 感官指標(biāo)測定 描述性感官分析［9］:樣品的感官評定采取描述性感官分析方法進(jìn)行評定，選取8名成員(4名男性，4名女性，年齡26～48歲)組成評定小組。為了使感官評定結(jié)果更為準(zhǔn)確，感官評定人員在對樣品進(jìn)行品評前先進(jìn)行特殊培訓(xùn)。評定人員首先對樣品香氣特征進(jìn)行討論，待對香氣描述達(dá)成一致時(shí)，對已選擇的5個(gè)感官屬性進(jìn)行進(jìn)一步的描述分析，最后對樣品進(jìn)行評估。樣品風(fēng)味強(qiáng)度的評價(jià)使用10點(diǎn)間隔尺度進(jìn)行評估(0代表不存在，9代表非常強(qiáng)烈)，評價(jià)完成后記錄評價(jià)結(jié)果，每個(gè)樣品重復(fù)三次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用origin8.0和DPS2000軟件分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Maillard熱反應(yīng)香精最適底物的確定

考慮到感官評定人員、評定重復(fù)次數(shù)及兩者的交互作用對產(chǎn)品的感官評定結(jié)果有較大的影響，因此對7個(gè)樣品的感官分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各個(gè)樣品在5個(gè)感官屬性方面均存在顯著差異(p＜0.001)，說明通過添加不同水解度的羊骨蛋白酶解液所制備的樣品之間具有明顯的風(fēng)味差異。理想的感官評定結(jié)果應(yīng)為樣品之間存在顯著差異，而評定人員、重復(fù)次數(shù)差異不顯著，但此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示評定人員在羊肉味(p＜0.001)和烤肉味(p＜0.05)上差異顯著，重復(fù)次數(shù)在回味感(p＜0.05)上存在顯著差異，而相對來說，以上情況較為普遍，這可能是由于評定人員在描述感覺時(shí)采用的評分尺度不同。樣品×重復(fù)次數(shù)、評定人員×重復(fù)次數(shù)不存在交互作用，表明評定人員對樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)的數(shù)據(jù)不存在差異、可靠。然而，樣品×評定人員在羊肉味、仿真度、回味感上差異極顯著(p＜0.001)，肉味上差異顯著(p＜0.05)，表明不同評定人員對樣品在不同感官屬性上打分存在差異，經(jīng)過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中3名評定人員在打分上存在細(xì)微差異。由于樣品×評定人員除烤肉味外均存在差異，因此對其進(jìn)行校正F檢驗(yàn)，即將評定人員作為隨機(jī)變量處理，將樣本×人員的交互作用的誤差均方代替誤差均方作為分母對F值重新檢驗(yàn)計(jì)算［10］。由表3可見，考慮到人員的影響，經(jīng)校正后的樣品在5個(gè)感官屬性上存在極顯著差異，表明樣本在5個(gè)感官屬性上存在明顯區(qū)別。

表3 描述性感官分析主要因素和交互作用的方差分析Table 3 Results of analyses of variance for the main effect and their interaction in descriptive analysis

以不同水解度羊骨蛋白酶解液為基料制備的羊肉香精感官分析結(jié)果和Duncan多重比較檢驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，與未添加羊骨蛋白酶解液制備的香精樣品相比，由不同水解度制備的樣品之間在不同的感官屬性得分上均存在不同程度的差異，說明羊骨蛋白酶解液的添加對產(chǎn)品感官特性影響較大。其中，MPF1和MPF2具有較強(qiáng)的烤肉味，但在羊肉味、肉味、仿真度、回味感上相對較弱;MPF3和MPF4在各個(gè)感官屬性上較為均勻;對比其它幾個(gè)樣品，MPF5表現(xiàn)出明顯的羊肉味、肉味、烤肉味，MPF6則顯現(xiàn)出極強(qiáng)的仿真度和回味感。MPF0則僅僅呈現(xiàn)相對較強(qiáng)的烤肉味，其它幾個(gè)感官屬性相對較弱。這一結(jié)果充分表明單純依靠純氨基酸混合物和植物水解蛋白制備的肉味香精不能完全模擬天然肉品風(fēng)味，且當(dāng)添加不同水解度羊骨蛋白酶解液時(shí)，所制備的產(chǎn)品其風(fēng)味差異明顯。這可能由于羊骨蛋白在酶解過程中不僅產(chǎn)生大量的游離氨基酸，而且解離出不同分子量的肽段。在參與Maillard反應(yīng)過程中，不同分子量的肽和不同比例混合的游離氨基酸會(huì)產(chǎn)生大量不同或不同量的風(fēng)味化合物，最終導(dǎo)致樣品風(fēng)味差異顯著。綜上所述，發(fā)現(xiàn)輕度的酶解或過度的酶解均不利于熱反應(yīng)產(chǎn)品各個(gè)感官風(fēng)味的呈現(xiàn)，只有添加適度的酶解液才有利于提升樣品的風(fēng)味，因此，本實(shí)驗(yàn)選取水解度為 25.92% ～30.29%為Maillard反應(yīng)最適底物。

圖1 不同DH制備Maillard反應(yīng)樣品感官屬性多重比較分析Fig.1 Results of Duncan’s multiple comparison test on mean sensory scores of 6 MPF samples

2.2 Maillard反應(yīng)羊肉香精均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)相似，是通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的整齊可比性，每個(gè)因素的水平均需進(jìn)行重復(fù)，這就導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增多。均勻設(shè)計(jì)從均勻性出發(fā)，不考慮整齊可比性，讓實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)充分地均勻分散，即用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)安排多因素、多水平實(shí)驗(yàn)［11］。本研究是對Maillard反應(yīng)基本配方和反應(yīng)條件的摸索，采用均勻設(shè)計(jì)不僅可以大大減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，而且能夠得到較好的反映產(chǎn)品特征的實(shí)驗(yàn)條件。選用U12(63×127)表，Maillard反應(yīng)條件采用六水平，其它原料均采用十二水平，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。

考慮到各個(gè)因子之間存在一定的交互作用，對表4中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析［12］，結(jié)果見表5。

可得回歸方程:Y=-0.080+1.363X1+0.053X30.002X6X10+0.001X7X8，相關(guān)系數(shù) R=1.0000，顯著水平α=0.0035，剩余標(biāo)準(zhǔn)差 S=0.0001573，F(xiàn)值 =49999.9250 ＞ F臨界(10，1，0.0035)=9998.94，方程通過檢驗(yàn)。

表4 Maillard反應(yīng)均勻設(shè)計(jì)表Table 4 The uniform designs of Maillard reaction

表5 回歸關(guān)系和各偏回歸系數(shù)的F檢驗(yàn)Table 5 Regression relationship and F-test of partial regression coefficient

2.3 最佳條件的確定

對均勻設(shè)計(jì)回歸模型尋找最優(yōu)值，得到Maillard反應(yīng)的最優(yōu)條件:反應(yīng)初始pH6.5、溫度125℃、時(shí)間180min、半胱氨酸 1.369g、丙氨酸 0.2g、?；撬?2.5g、硫胺素2.5g、葡萄糖4.0g、水解植物蛋白1.428g、氧化羊脂12.0g。對此條件進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)平行3次，平均評分為8.6，表明此條件能夠得到較好的羊肉香精。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用描述性感官分析對羊骨蛋白酶解液制備的熱反應(yīng)香精進(jìn)行綜合分析評價(jià)，利用均勻設(shè)計(jì)模擬優(yōu)化模式Maillard反應(yīng)配方與條件，最佳方案為:添加水解度為25.92%～30.29%的羊骨蛋白酶解液100.0g，反應(yīng)初始pH6.5、溫度125℃、時(shí)間180min、半胱氨酸1.369g、丙氨酸0.2g、牛磺酸2.5g、硫胺素2.5g、葡萄糖4.0g、水解植物蛋白1.428g、氧化羊脂12.0g，在此條件下進(jìn)行反應(yīng)，感官綜合得分為8.6，能夠得到整體風(fēng)味良好的羊肉香精。

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