張 曦， 宋君秋， 汪 云， 李 欣， 康 毅， 婁建石

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，天津300070)

冠心病是由于冠狀動(dòng)脈固定性或動(dòng)力性病變，致使血管管腔狹窄堵塞，引起心肌缺血缺氧或壞死的缺血性心臟病，是人類(lèi)心血管健康的最大威脅。中醫(yī)藥治療冠心病在緩解患者癥狀、改善病理?yè)p傷方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

冠心蘇合具有寬胸、理氣、止痛的功效，臨床用于治療冠心病心絞痛。本課題采用血清藥理學(xué)方法采集含藥血清，利用生物化學(xué)檢測(cè)手段探討冠心蘇合抗氧化損傷致心肌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 冠心蘇合膠囊 (天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)102009)、Hoechst染色試劑盒 (批號(hào):KGA211)、BCA蛋白測(cè)定試劑盒 (批號(hào):KGPBCA)、caspase-3活性測(cè)定試劑盒(批號(hào):KAG203)均來(lái)自凱基生物有限公司、兔抗鼠多克隆抗體Bcl-2(批號(hào):BS1511，Bioworld公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗 (批號(hào):BS10350，Bioworld公司)、β-actin內(nèi)參 (批號(hào):AP0060，Bioworld公司)、兔抗鼠多克隆抗體Bax(批號(hào)20110910，ABcam公司，美國(guó))、倒置相差顯微鏡 (型號(hào):CK40-F200，Olympus公司生產(chǎn)，日本)、CO2孵箱 (型號(hào):3111，Thermo Electron Corporation，美國(guó))、酶標(biāo)儀 (型號(hào):Model680，BIORAD公司生產(chǎn)，美國(guó))、熒光顯微鏡(型號(hào):MF41，Olympus公司，日本)Western bloting相關(guān)耗材由BIORED公司提供。

1.1.2 動(dòng)物 SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量230～280 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物合格證號(hào)0005984)。飼養(yǎng)條件:溫度 (22±2)℃;相對(duì)濕度40%～60%;光照周期，12/12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水;SD新生乳鼠 (3 d內(nèi))，25只，雌雄不拘 (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號(hào)0005356)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清與空白血清的制備 取40只SD種大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，冠心蘇合組30只。冠心蘇合組大鼠灌胃給予冠心蘇合膠囊，800 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg，每日兩次，連續(xù)給藥4 d。正常對(duì)照組灌胃給予等量生理鹽水，操作同上。末次給藥后1 h，無(wú)菌條件下，經(jīng)腹主動(dòng)脈充分取血，分離含藥血清。過(guò)濾除菌，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及氧化損傷模型的確立 取新生3 d內(nèi)的SD乳鼠15只，在超凈臺(tái)中剪下心臟，加入37℃ 孵育的混合消化酶液(0.05%胰蛋白酶和0.055%膠原酶Ⅱ溶液)將心肌組織消化成單細(xì)胞懸液，差速貼壁去除非心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時(shí)以1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，加入BrdU，于37℃、5%CO2孵箱中孵育。細(xì)胞貼壁48 h后方可換液，待大部分心肌細(xì)胞有搏動(dòng)時(shí)加入H2O2使其終濃度分別為 100、200、400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4 h，確立最合適的H2O2損傷濃度和時(shí)間。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、正常血清對(duì)照組、氧化損傷模型組、冠心蘇合高劑量組 (含藥血清原液)、中劑量組 (按含藥血清原液∶DMEM=3∶1配制)和低劑量組(按含藥血清原液∶DMEM=1∶1配制)，除陰性對(duì)照組外，各組細(xì)胞在給藥后2 h均加入終濃度為100 μmol/L 的 H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 培養(yǎng)結(jié)束后，各組細(xì)胞棄去原有培養(yǎng)基，加入 10 μL MTT(5 mg/mL)和90 μL無(wú)FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO，490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。細(xì)胞存活率 (%)=(OD檢測(cè)組/OD對(duì)照組) ×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色形態(tài)學(xué)研究 取6孔板中穩(wěn)定搏動(dòng)2 d原代心肌細(xì)胞建立H2O2氧化損傷模型，取各濃度藥物作用于心肌細(xì)胞 (實(shí)驗(yàn)分組與MTT相同)，在培養(yǎng)箱中37℃孵育1 h;棄去6孔板中液體，PBS洗細(xì)胞3次;4%甲醛于4℃固定細(xì)胞10 min;棄去甲醛，PBS洗細(xì)胞2次，自然晾干;每孔加入Hoeschst33258染料150 μL，避光染色10 min后水沖凈晾干;熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.6 caspase-3活性的測(cè)定

(1)蛋白定量

根據(jù)BCA試劑盒要求繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量蛋白。

(2)caspase-3檢測(cè)

吸取50 μL細(xì)胞裂解上清 (蛋白質(zhì)量濃度為100 ～200 μg/mL);加入 50 μL 的 Reaction buffer;加入5 μL caspase-3 Substrate并于37℃避光孵育4 h;用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)400 nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-3活化程度。

1.2.7 Western blot測(cè)定Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)收集各組藥物作用后的心肌細(xì)胞，裂解后BCA法進(jìn)行蛋白定量;用loading buffer配制好上樣蛋白，100℃煮蛋白20 min，分裝，-20℃保存;根據(jù)蛋白分子量制備12%的分離膠和積層膠;上樣完畢后按照積層膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V電泳，待溴酚藍(lán)移至玻璃板最下端即可停止電泳。裝好轉(zhuǎn)膜裝置，恒流350 mA電轉(zhuǎn)2.5 h;按照marker指示切割目的條帶，室溫下封閉2 h;加入含兔抗小鼠多克隆抗體 (稀釋比例為1∶1 000)的一抗工作液，4℃過(guò)夜;TBST搖洗3次，10 min/次;加入鼠抗兔IgG抗體，25℃孵育2 h;TBST搖洗3次，將多余二抗洗凈，10 min/次;ECL超敏發(fā)光液處理目的條帶1 min，暗室中曝光，顯影，定影，待X光片干透即可掃描，用Quantity one軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷存活率的影響 與陰性對(duì)照組比較，H2O2處理時(shí)細(xì)胞存活率顯著降低 (P＜0.01)，與模型組比較，冠心蘇合含藥血清組細(xì)胞存活率均明顯提高(P＜0.01)，且呈劑量相關(guān)性 (見(jiàn)表1)。

表1 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷的原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

表1 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷的原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

注:與陰性對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01。

分 組 細(xì)胞存活率/%陰性對(duì)照組100模型組 33.16±4.99空白血清組 40.03 ±3.24＊＊冠心蘇合低劑量組 49.72±4.32＊＊##冠心蘇合中劑量組 70.75±3.95＊＊##冠心蘇合高劑量組 82.39±8.52＊＊##

2.2 Hoechst33258染色結(jié)果顯示 與模型組相比，空白血清組能稍微減少細(xì)胞核固縮凝聚，冠心蘇合各劑量組隨著藥物濃度升高細(xì)胞核固縮凝聚減輕，碎片依次減少，說(shuō)明冠心蘇合各劑量組能夠有效的抑制細(xì)胞凋亡。

2.3 caspase-3活性的測(cè)定結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，H2O2處理使得caspase-3活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組相比空白血清組變化不大;與模型組及空白血清組相比，caspase-3活性隨含藥血清濃度增高而降低，說(shuō)明含藥血清能夠阻止caspase-3的激活，結(jié)果如表2。

2.4 Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)顯示，與陰性對(duì)照組相比，H2O2處理使得Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào) (P＜0.01);與模型組相比，冠心蘇合給藥組能夠下調(diào)Bax水平，上調(diào)Bcl-2水平 (P＜0.01)且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(見(jiàn)表3，圖1)。

表2 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷的心肌細(xì)胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

表2 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷的心肌細(xì)胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

注:與陰性對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01;與模型相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲▲P＜0.01。

組 別 (OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照)/%陰性對(duì)照組100.0±0.00模型組 160.8 ±18.1＊＊空白血清組 157.1 ±19.3＊＊##冠心蘇合低劑量組 140.4 ±17.3＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 124.5 ±9.2＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 118.9 ±11.6＊＊##▲▲

表3 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

表3 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

注:與陰性對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 ABcl-2∶Aβ-actin ABax∶Aβ-actin陰性對(duì)照組1.21±0.04 0.73±0.03空白血清組 0.81 ±0.05＊＊## 1.77 ±0.04＊＊##模型組 0.70±0.02＊＊ 1.88±0.01＊＊冠心蘇合低劑量組 0.75±0.04＊＊##▲▲ 1.62±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 0.85±0.06＊＊##▲▲ 1.59±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 1.07±0.05＊＊##▲▲ 1.37±0.03＊＊##▲▲

圖1 冠心蘇合含藥血清對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2

3 討論

冠心蘇合膠囊含有蘇合香、冰片、乳香、檀香、青木香等，具有芳香開(kāi)竅、理氣止痛的功效［1］，是治療冠心病心絞痛、心肌梗死等疾病的驗(yàn)方。國(guó)內(nèi)學(xué)者［2-4］對(duì)此多有研究。但關(guān)于該方是否具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用研究鮮有報(bào)道。

應(yīng)用血清藥理學(xué)方法其價(jià)值在于，一是克服了用中藥制劑直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，中藥制劑本身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾;二是實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)有較好的一致性，不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用，而且還能反映可能藥物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，為從細(xì)胞分子水平研究中藥藥理學(xué)提供了新的手段［5］。

本實(shí)驗(yàn)采用心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)心臟在氧化損傷過(guò)程中氧化增強(qiáng)反應(yīng)的原理，選用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，以模擬細(xì)胞病理模型。H2O2濃度在0.1～1 mmol/L范圍內(nèi)就能引起培養(yǎng)的心肌細(xì)胞早期的生物化學(xué)改變 (LDH釋放，MDA生成和細(xì)胞周期的改變)。采用MTT法觀察冠心蘇合含藥血清對(duì)氧化損傷的心肌細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合各劑量組能使損傷心肌細(xì)胞的存活率顯著上升，且具有明顯的劑量相關(guān)性，此結(jié)果表明冠心蘇合含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞過(guò)氧化損傷存在著明顯的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡最突出的特點(diǎn)是細(xì)胞凋亡起始于細(xì)胞核的改變，細(xì)胞核凋亡小體的形成即是細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度冠心蘇合含藥血清作用于H2O2損傷后的原代心肌細(xì)胞后，經(jīng)Hoechst 33258染色后發(fā)現(xiàn):H2O2損傷模型組可見(jiàn)到明顯的凋亡細(xì)胞特征——細(xì)胞膜完整，細(xì)胞染色質(zhì)斷裂聚集，固縮，可見(jiàn)到凋亡小體，符從冠心蘇合各劑量組凋亡小體隨濃度增加而減少。

Bcl-2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族中最受重視的，分為抑凋亡基因和促凋亡基因兩類(lèi)?；蜣D(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，Bcl-2蛋白能阻止并能消除多因素介導(dǎo)的凋亡，說(shuō)明Bcl-2基因處于凋亡調(diào)控的終末部分，其表達(dá)狀態(tài)可決定細(xì)胞的生存與死亡。Bax可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase-3蛋白酶，引起細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)Bax與Bcl-2的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生［7-8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合各劑量組可使模型損傷組細(xì)胞中Bcl-2水平上調(diào)，Bax水平下降，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。由此可推測(cè)，冠心蘇合含藥血清可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2與Bax的比值，使Bax/Bax同二聚體減少對(duì)細(xì)胞凋亡起到抑制作用的。

在caspase家族成員中，caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡下游的主要和關(guān)鍵執(zhí)行者，是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［9-10］。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度冠心蘇合含藥血清處理H2O2損傷后的心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，冠心蘇合含藥血清可阻止caspase-3途徑的激活，且呈一定劑量依賴(lài)性。

此外，CytoC、p-AKT/AKT、pERK/ERK等蛋白也可以從不同的通路驗(yàn)證凋亡的發(fā)生。硫氧還蛋白 (TRX)為細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)分子之一［11］，細(xì)胞缺氧時(shí)，TRX發(fā)生從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位，故檢測(cè)細(xì)胞裂解后懸液中TRX的表達(dá)也是探討藥物作用機(jī)制很好的指標(biāo)。近年來(lái)文獻(xiàn)資料顯示，熱休克蛋白家族在心肌缺血再灌注損傷中有良好的保護(hù)作用，可明顯提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性，減少了心肌梗死的面積［12］。

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