張杰，郗宏波，蘇賀靖，王艷萍

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

乳酸菌作為定居腸道中的有益菌群，具有維持人體中微生態(tài)平衡的作用，其益生作用逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注。乳制品是乳酸菌發(fā)酵應(yīng)用最多，也是最為成熟的領(lǐng)域。市售的酸奶大多數(shù)采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，但這兩種菌在腸道內(nèi)存活率較低，其有益作用受到了很大的限制[1]。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）作為益生菌的一種，具有良好的耐酸及膽汁抗性，所以干酪乳桿菌進(jìn)入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收等作用[2]。同時(shí)干酪乳桿菌，可降低血漿膽固醇，增強(qiáng)宿主對(duì)微生物病原體的非特異性抵抗力，加快清除腸道內(nèi)病原體，治療腸道菌群紊亂和增強(qiáng)腸道透性，從而防止食物過(guò)敏和急性腹瀉。近年來(lái)，由于對(duì)其宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效，干酪乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于功能性食品，特別是乳制品的開(kāi)發(fā)中，并逐漸為人們所關(guān)注[3]。

本實(shí)驗(yàn)以從日本傳統(tǒng)酸奶中分離選育出的干酪乳桿菌為試驗(yàn)菌株，結(jié)合傳統(tǒng)酸奶中常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵，確定最佳的適合酸奶加工的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮牛奶（無(wú)抗生素殘留）；脫脂奶粉：雀巢公司；白砂糖（一等品）；保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌：天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；干酪乳桿菌：前期實(shí)驗(yàn)從日本傳統(tǒng)酸奶中分離純化得到。

培養(yǎng)基：改良MRS培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基等按文獻(xiàn)[4]的方法配置。

1.2方法

1.2.1 菌種活化

將保存的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌按1%（體積比）接種至液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，并反復(fù)活化2次～3次。

將1%MRS菌液分別接種于脫脂乳培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，并反復(fù)活化2次～3次。

1.2.2 工藝流程

原料鮮奶→凈化→脂肪含量標(biāo)準(zhǔn)化→配料（加白砂糖）→過(guò)濾→預(yù)熱→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接種→分裝→發(fā)酵→冷卻后熟、冷藏、成品。

1.2.3 檢驗(yàn)方法

1.2.3.1 感官評(píng)價(jià)

由本實(shí)驗(yàn)室7人組成感官評(píng)定小組，采用百分制對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)分。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of sensory quality

1.2.3.2 酸度測(cè)定

采用NaOH滴定法，以T表示為：在150 mL錐形瓶中移入10 mL發(fā)酵樣品，準(zhǔn)確到10 mg，加入約20 L蒸餾水，用0.1N NaOH滴定，按下式計(jì)算酸度（°T）

A=10×耗Na0H量×0.1×10

1.2.4 單一菌種（干酪乳桿菌）發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

以不同接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、乳固含量分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定滴定酸度，評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)品的感官風(fēng)味。

1.2.5 混合菌發(fā)酵最佳參數(shù)實(shí)驗(yàn)

有研究表明[5]，嗜熱鏈球菌（St）及保加利亞乳桿菌（Lb）在1∶1的比例下接種，發(fā)酵的酸乳口感最佳。本次實(shí)驗(yàn)將這兩類乳酸菌以1∶1的比例混勻同干酪乳桿菌以不同比例混合，作為發(fā)酵劑，進(jìn)行混合菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。以酸奶的感官評(píng)價(jià)及酸度為指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.6 酸奶發(fā)酵

以正交試驗(yàn)得出的最佳條件進(jìn)行酸奶發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同接種量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

不同接種量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響見(jiàn)圖1。

圖1 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸及發(fā)酵狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of dosage of inoculum on the acidity and quality of products

由圖1顯示，發(fā)酵酸度隨著接種量的增加而增加。當(dāng)接種量達(dá)到6%時(shí)增加趨勢(shì)緩慢，到7%以上的接種量時(shí)就有大量的乳清析出并且逐漸增加。在3%的接種量時(shí)，各方面指標(biāo)均不如5%的接種量，綜合上述原因，在正交實(shí)驗(yàn)中的接種量設(shè)為4%、5%、6%。

2.1.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

由2.1.1確定接種量為5%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵時(shí)間為6 h～8 h過(guò)程中，其逐漸開(kāi)始凝固，所以將發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)為6、8、10、12 h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所測(cè)的各項(xiàng)結(jié)果如圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸及發(fā)酵狀態(tài)的影響Fig.2 Effects of time on the acidity and quality of products

由圖2可以看出，酸度隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。但在6 h～7 h這個(gè)時(shí)間段內(nèi)酸奶沒(méi)有凝固，8 h后開(kāi)始凝固并且狀態(tài)逐漸增強(qiáng)，但在10 h后開(kāi)始有乳清析出，并且隨著時(shí)間增加明顯增加。將正交試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間定為10 h。

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)酸奶發(fā)酵的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸及發(fā)酵狀態(tài)的影響Fig.3 Effects of temperature on the acidity and quality of products

由2.1.1確定接種量為5%；由2.1.2確定發(fā)酵時(shí)間為10 h，干酪乳桿菌種活化的最佳溫度為35℃～40℃的范圍內(nèi)，所以將其發(fā)酵溫度分別設(shè)為35、36、37、38、39、40℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所測(cè)的各項(xiàng)結(jié)果如下。

酸奶的酸度在35℃～37℃這段溫度內(nèi)，隨發(fā)酵溫度的增加而增加，但在37℃后其酸度隨溫度的增加而降低。同時(shí)在35℃時(shí)酸奶凝固狀態(tài)不好，有大量乳清析出，綜合上述原因，在混合菌正交試驗(yàn)中的發(fā)酵溫度設(shè)為 35、37、39℃。

2.1.4 不同乳固體含量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

不同乳固體含量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乳固體含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸及發(fā)酵狀態(tài)的影響Fig.4 Effects of milk solids content on the acidity and quality of products

乳固體含量越高，發(fā)酵產(chǎn)酸速度越快，且凝乳質(zhì)地良好，乳清析出少。固體含量為10%組時(shí)，凝乳質(zhì)地差，乳清析出嚴(yán)重，感官粗糙；乳固體含量為12%、13%和14%組，可得到良好的酸度及凝乳質(zhì)地，隨著乳固含量的增加凝乳質(zhì)地隨之變硬。本實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的酸奶產(chǎn)品，牛奶中總干物質(zhì)濃度要達(dá)到12%以上方可。

2.2 混合菌發(fā)酵最佳參數(shù)實(shí)驗(yàn)

在單一菌種單一因素發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇菌種配比、接種量、發(fā)酵溫度和乳固含量四個(gè)主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9（34）正交試驗(yàn)，從而確定發(fā)酵酸奶工藝最佳條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2確定發(fā)酵工藝條件的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of L9（34）orthogonal test on fermentation technology conditions

由表2極差分析可知，各因素對(duì)產(chǎn)酸影響大小順序?yàn)椋航臃N量＞菌種配比＞發(fā)酵溫度＞乳固體含量。隨著干酪乳桿菌比例增大，產(chǎn)酸作用也明顯增強(qiáng)。而因素對(duì)感官的影響大小順序?yàn)椋喝楣腆w含量＞菌種配比＞發(fā)酵溫度＞接種量，乳固體含量對(duì)口感影響最大。

容易看出，較低的溫度、接種量及乳固體含量制約產(chǎn)酸；若增加乳固體含量、接種量及改變菌種配比可彌補(bǔ)低溫發(fā)酵不足。所以，在一定范圍內(nèi)綜合因素之間有著相互調(diào)節(jié)和制約作用。綜合產(chǎn)酸能力、組織狀態(tài)及感官最佳工藝水平組合A1B2C2D3（D2）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果與分析，混合菌種最佳發(fā)酵工藝菌種配比1∶1∶2，接種量為5%，發(fā)酵溫度為37℃，乳固體含量不得低于12%，考慮到生產(chǎn)成本、乳固體含量12%，即可滿足產(chǎn)品品質(zhì)要求。

2.3 酸奶發(fā)酵

以嗜熱鏈球菌：保加利亞乳桿菌：干酪乳桿菌比例為1∶1∶2的混合菌，接種量為5%，乳固體含量為12%，在37℃進(jìn)行有氧發(fā)酵。測(cè)得酸度為76.4°T，感官得分為86。

3 結(jié)論

1）單一菌種發(fā)酵試驗(yàn)表明，干酪乳桿菌生產(chǎn)發(fā)酵酸牛奶的工藝條件：37℃，5%，乳固體含量12%以上，發(fā)酵時(shí)間為8 h～10 h。

2）混合菌種在發(fā)酵工藝中對(duì)產(chǎn)品質(zhì)地、風(fēng)味、感官等受菌種配比、接種量、發(fā)酵溫度、乳固體含量等各種因素的影響，其中受乳固體含量及菌種配比影響較大，但各因素之間也存在著相互調(diào)節(jié)、又相互制約的關(guān)系。通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，得出干酪乳桿菌酸奶最佳發(fā)酵工藝為混合菌種配比（嗜熱鏈球菌：保加利亞乳桿菌：干酪乳桿菌）為1∶1∶2，接種量為5%，37℃有氧發(fā)酵，考慮到生產(chǎn)成本、乳固體含量定為12%。

3）據(jù)此發(fā)酵工藝生產(chǎn)的酸奶，凝固質(zhì)地硬，無(wú)乳清析出，酸味柔和，酸甜適口，風(fēng)味良好。

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