季紅，吳正鈞，韓瑨，周方方

（乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海 200436）

乳酸菌是眾多發(fā)酵食品的生物基礎[1]，食品中的乳酸菌不僅保持了原料中的營養(yǎng)成分，并且抑制了腐敗菌及病原菌的滋長[2]。乳酸菌對腐敗菌及病原菌的抑制作用可能依靠其代謝產(chǎn)物，比如有機酸（乳酸和醋酸），過氧化氫，雙乙酰和細菌素[1－3]。其中，有些細菌素只能抑制同一細菌屬中的某一種細菌，而有些細菌素卻能廣泛抑制革蘭氏陽性菌[3－6]。近年，乳酸菌的這些功能引起了研究者們的廣泛興趣，很多工作集中在細菌素產(chǎn)生的分離及新的細菌素的提純。然而，乳酸菌中產(chǎn)細菌素菌株的檢出率僅為0.2%，因此，對于細菌素產(chǎn)生菌的分離篩選及新的細菌素的獲得，需要研究大量食品樣本[7]。

本文分析了本實驗室保存的10余株乳桿菌對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制和殺滅作用，其中，植物乳桿菌ST－III（CGMCC 0848）可以通過產(chǎn)生細菌素類的物質(zhì)抑制和殺滅金黃色葡萄球菌10384和腸炎沙門氏菌54001。

1 料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌ST－Ⅲ（Lactobacillus plantarumST－Ⅲ）；干酪乳桿菌 LC2W（Lactobacillus caseiLC2W）；植物乳桿菌 9－9（Lactobacillus plantarum9－9）；短乳桿菌22－22（Lactobacillus brevis22－22）；鼠李糖乳桿菌 Y37（Lactobacillus rhamnosusY37）；本實驗室保藏菌株（經(jīng)初步鑒定均為乳桿菌）：編號分別為 10、13、16、17、18；金黃色葡萄球菌10384（Staphylococcus aureus10384）；腸炎沙門氏菌54001（Salmonella enteritis54001）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體/固體培養(yǎng)基：德國Merck公司；營養(yǎng)瓊脂及營養(yǎng)肉湯：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 試劑

乳酸、乙酸鈉、冰乙酸、NaOH、NaCl：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K（20 mg/mL）：美國Sigma公司。

1.1.4 儀器

SPECORD 205分光光度計：德國jena公司；J－30I離心機：美國Beckman公司；0.22 μm微孔濾膜：美國Millipore公司；BUG厭氧培養(yǎng)箱：法國Jouan公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

無細胞發(fā)酵上清液（CFS）：新鮮培養(yǎng)菌株以3%的接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h。發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min，上清液用0.22 μm膜過濾得無細胞上清液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

指示菌菌懸液：挑取新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌10384或腸炎沙門氏菌54001單菌落接種于1 mL營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液以15 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體用0.85%無菌生理鹽水洗滌兩次，用0.85%無菌生理鹽水制備成OD600=0.7的菌懸液，0℃～4℃保存?zhèn)溆?/p>

含菌懸液培養(yǎng)基：取1 mL金黃色葡萄球菌10384菌懸液于100 mL營養(yǎng)瓊脂，混合均勻，為樣品A；取1 mL沙門氏菌54001菌懸液于100 mL營養(yǎng)瓊脂，混合均勻，為樣品B；按上述方法分別將1 mL兩株菌菌懸液與100 mL營養(yǎng)肉湯混合，即為樣品C（含金黃色葡萄球菌10384）及樣品D（含沙門氏菌54001）。

MRS對照液：采用乳酸將無菌MRS液體調(diào)pH至乳酸菌發(fā)酵的終pH 4.0。

菌懸液樣品：取1mL指示菌菌懸液（OD600=0.7）100 mL無菌生理鹽水中，震蕩均勻，即為菌懸液E（含金黃色葡萄球菌10384）及菌懸液F（含沙門氏菌54001）。

1.2.2 產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選

牛津杯法[8]：將樣品A及樣品B分別傾倒平板（每板10 mL），冷卻后于適當位置放置2個牛津杯，分別加入100 μL待測CFS及空白對照液，37℃培養(yǎng)16 h。測量其抑菌圈大小，以待測液產(chǎn)生的抑菌圈半徑大于MRS對照液的為有抑菌活性。

孔擴散法[8]：將樣品A及樣品B分別傾倒平板（每板15 mL），冷卻后于適當位置打2個孔并挑出孔內(nèi)營養(yǎng)瓊脂，以少量空白營養(yǎng)瓊脂封底，待封底凝固后，分別加入100 μL待測CFS及MRS對照液，37℃培養(yǎng)16 h。測量其抑菌圈大小，以待測液產(chǎn)生的抑菌圈半徑大于MRS對照液的為有抑菌活性。

OD值法（復篩）：分別取樣品C及D 4.5 mL，一份加入0.5 mL待測CFS，另一份加入空白對照，37℃培養(yǎng)6 h測定OD值（600 nm）[16]。以待測CFS OD值小于其MRS對照液OD值的為有抑菌活性（對照液37℃恒溫放置）。

1.2.3 代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌活性

取植物乳桿菌ST－ⅢCFS 5 mL 4份（其中一份不經(jīng)處理，作為對照），分別加入過氧化物酶、胰蛋白酶、蛋白酶K，使其終濃度均為0.5 mg/mL，分別用2 mol/L的NaOH調(diào)至所用酶最適pH，37℃下孵育1 h，用2 mol/L的HCl調(diào)pH至CFS原始pH，參照牛津杯法[8]測定其抑菌活性。

1.2.4 抑菌活性研究

取0.5 mL CFS分別與4.5 mL樣品C或者樣品D混合均勻，以MRS對照液作為空白，于37℃分別培養(yǎng)2、4、6、8 h，測定 OD 值（600 nm）。

制備不同發(fā)酵時間的CFS（37℃培養(yǎng)6、8、12、24、32 h）。上述樣品分別取0.5 mL與4.5 mL樣品C或者樣品D混合均勻，以MRS對照液為空白，于37℃下培養(yǎng)一定時間（參照上述實驗結(jié)果），并測定OD值（600 nm）。

以最佳發(fā)酵時間制備CFS（參照上述實驗結(jié)果），采用 1 mol/L的 NaOH 分別調(diào) pH 至 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，分別取0.5 mL與4.5 mL樣品C或者樣品D混合均勻，以相應pH的MRS為對照液，于37℃下培養(yǎng)上述實驗所確定最佳作用時間測定OD值（600 nm）。

分別對CFS及其相應pH的MRS進行倍半稀釋，取0.5 mL與4.5 mL樣品C或者樣品D混合，于37℃下培養(yǎng)最適時間測定OD值（600 nm）。

1.2.5 殺菌作用的測定

CFS作用不同時間的殺菌性：取0.5 mL CFS（以乳酸調(diào)節(jié)pH的MRS為對照），加入4.5 mL菌懸液E或F，25℃放置30、60 min后，菌落計數(shù)（30℃，48 h）。

CFS在指示菌生長過程中的殺菌性：取0.5 mL CFS（對照同上），加入4.5 mL菌懸液培養(yǎng)基C或D，25℃放置30、60 min，菌落計數(shù)（30℃，48 h）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選

為排除實驗中有機酸對抑菌作用的干擾，以相應pH的MRS作為待測液的對照。同時，選取金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的代表，以孔擴散法和牛津杯法對所給菌株進行抑菌性的初篩，旨在尋求對兩株指示菌均有抑菌作用且作用較顯著的乳酸菌菌株?？讛U散法及牛津杯法抑菌活性結(jié)果見表1及表2，圖1則列舉了LC2W及ST－Ⅲ孔擴散法對金黃色葡萄球菌10384的抑菌作用。

表1 10株乳酸菌孔擴散法的抑菌活性Table 1 Inhibition of S.aureus 10384 and S.enteritis 54001 by Lactobacillus with well diffusion method

表2 10株乳酸菌牛津杯法抑菌活性Table 2 InhibitionofS.aureus10384andS.enteritis54001by Lactobacilluswithdiscdiffusionmethodutilizingstainlessoxfordcups

圖1 孔擴散法對金黃色葡萄球菌10384的抑菌活性Fig.1 Inhibition of S.aureus 10384 by ST-Ⅲ&LC2W with well diffusion method

由表 1和表 2可見，LC2W、ST－Ⅲ、17、18對沙門氏菌54001和金黃色葡萄球菌10384均具有顯著的抑菌作用，尤以植物乳桿菌ST－Ⅲ對這兩株菌的抑制作用為最強。

為進一步確證這幾株乳酸菌菌株對兩株指示菌的抑制作用，采用了OD值法驗證其抑菌效率，4株乳酸菌對兩株指示菌的抑制作用見圖2及圖3。

圖2 OD值法對沙門氏菌54001的抑制作用Fig.2 Inhibition of S.enteritis 54001 by Lactobacillus

圖3 OD值法對金黃色葡萄球菌10384的抑制作用Fig.3 Inhibiton of S.aureus 10384 by Lactobacillus

由圖2及圖3可知，4株復篩菌株對2株指示菌的抑菌作用，與上述孔擴散法及杯碟法的結(jié)果一致，17及18菌株的作用弱于LC2W及ST－Ⅲ，對沙門氏菌54001及金黃色葡萄球菌10384抑制作用最強的仍然是植物乳桿菌ST－Ⅲ，且其對金黃色葡萄球菌10384的抑菌性大于沙門氏菌54001。因此，后續(xù)試驗選取ST－Ⅲ進行深入研究。

2.2 代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌活性

乳酸菌在生長代謝過程中，有可能產(chǎn)生過氧化氫，從而抑制細菌的生長。將植物乳桿菌ST－ⅢCFS用過氧化氫酶處理，并對比原發(fā)酵液的抑菌活性，旨在排除該過氧化氫帶來的抑菌活性，結(jié)果見表3。

表3 代謝產(chǎn)物酶處理后的抑菌活性Table 3 Inhibitory of S.aureus 10384 and S.enteritis 54001 after enzymolysis

在排除過氧化氫的基礎上，將植物乳桿菌ST－ⅢCFS采用相關蛋白酶處理，若其抑菌活力下降，則可認為該乳桿菌在大寫過程中產(chǎn)生了蛋白類抑菌物質(zhì)，該結(jié)果同樣見表3。

植物乳桿菌ST－ⅢCFS經(jīng)過氧化物酶處理后，對金黃色葡萄球菌10384的抑菌圈相差不大，對腸炎沙門氏菌54001的抑菌圈略有下降，可見該菌株發(fā)酵液中主要抑菌物質(zhì)不是過氧化氫，另有其他物質(zhì)。經(jīng)蛋白酶K及胰蛋白酶處理的植物乳桿菌ST－ⅢCFS，與對照相比，對腸炎沙門氏菌54001及金黃色葡萄球菌10384的抑制作用均有明顯下降?？梢姲l(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)對蛋白酶比較敏感，由此可判定抑菌物質(zhì)中含有蛋白成分，即細菌素。

2.3 指示菌及待測菌株的生長曲線

指示菌在營養(yǎng)肉湯中生長，在不加任何抑菌物質(zhì)的情況下，于不同時間段下測定OD值（λ=600 nm）。植物乳桿菌ST－Ⅲ在發(fā)酵的不同時間測發(fā)酵液pH，以此判斷生長程度結(jié)果見圖4、圖5。

由圖4可知，指示菌在8 h時進入生長的穩(wěn)定期，已生長完全，所以選擇發(fā)酵8 h用作實驗。由圖5可知ST－Ⅲ在生長12 h時進入生長穩(wěn)定期，到36 h時pH已經(jīng)比較低，而有機酸對實驗的干擾比較大，因此選擇發(fā)酵12 h用作實驗。

圖4 指示菌生長曲線圖Fig.4 Growth of S.aureus 10384 and Salmonella enteritis 54001

圖5 ST-Ⅲ不同發(fā)酵時間的pH變化Fig.5 pH change of L.plantarum ST-Ⅲ

2.4 抑菌活性的測定

2.4.1 無細胞發(fā)酵上清液對兩株指示菌作用不同時間的抑菌活性

細菌素的產(chǎn)生除了與菌株自身性質(zhì)有關外，培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)時間對細菌素的產(chǎn)生也有很大影響。培養(yǎng)基只有在一定的培養(yǎng)時間滿足細菌生長的前提下，才能保證細菌素的大量產(chǎn)生和分泌[9]。本實驗用發(fā)酵12 h的ST－Ⅲ無細胞發(fā)酵上清液與指示菌一起培養(yǎng)，在不同時間段測定OD值（600 nm），根據(jù)以下公式得出不同時間段的抑菌活性：抑菌率（%）＝（對照MRS的OD值－無細胞發(fā)酵上清液的OD值）/對照MRS的OD值×100%[10]，見圖 6。

圖6 發(fā)酵12 h所得無細胞上清液作用不同時間的抑菌活性Fig.6 Relationship between inhibition and fermentation time

由圖6可知，隨著時間的增長抑菌率呈上升的趨勢，在8 h抑菌效果最好，而指示菌生長曲線顯示8 h時指示菌已經(jīng)生長成熟，因此選用發(fā)酵8 h的指示菌作為實驗樣本。

2.4.2 植物乳桿菌ST-Ⅲ在不同pH及不同發(fā)酵時間下對兩株指示菌的抑菌活性

植物乳桿菌ST-Ⅲ在生長12 h時進入生長穩(wěn)定期，但隨著生長時間的增加，pH逐漸降低，存在乳酸的影響，因此以相應pH的MRS為對照排除乳酸的影響來研究不同發(fā)酵時間的無細胞上清液的抑菌活性，結(jié)果見圖7。而隨著發(fā)酵時間的延長，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發(fā)酵液pH逐漸降低，為進一步研究pH變化對于抑菌活性的影響，人為將CFS調(diào)pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，分別測定抑菌活性，試驗結(jié)果見圖8。

圖7 發(fā)酵不同時間的無細胞上清液的抑菌活性Fig.7 Relationship between CFS of different fermentation time and inhibitory activity

圖8 不同pH下無細胞發(fā)酵上清液的抑菌活性Fig.8 Relationship between pH and inhibitory activity

由圖7可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ發(fā)酵12 h的抑菌活性最強，且對金黃色葡萄球菌的抑菌作用大于沙門氏菌，6 h到12 h抑菌率呈逐漸上升之勢，而24 h時完全被乳酸的作用所掩蓋。因此選用發(fā)酵12 h進行下一步的實驗。

由圖8可知，隨著pH的上升，抑菌率呈下降的趨勢，當pH達到7時，幾乎沒有抑菌活性，這說明ST-Ⅲ所產(chǎn)生的乳酸菌素在酸性或弱酸性條件下穩(wěn)定，并能保持較高的抑菌活性。這與報道中許多乳酸菌產(chǎn)生的細菌素在低pH下具有較強的抑菌活性一致，其原因可能是pH環(huán)境會使細菌素的蛋白質(zhì)結(jié)構構象發(fā)生變化，因而引起抑菌活性的變化 。另外在pH 6.0時仍有較顯著的抑菌活性也可證明抑菌物質(zhì)除了有機酸外，還有其他，即為乳酸菌素。

2.4.3 倍半稀釋下無細胞發(fā)酵上清液對兩株指示菌的抑菌活性

將無細胞發(fā)酵上清液進行倍半稀釋，加入量不變，研究其具有抑菌活性的最低濃度，分別見圖9及圖10。

圖9 不同pH倍半稀釋對金黃色葡萄球菌的抑菌活性Fig.9 Inhibiton loss of S.aureus10384 due to concentration

圖10 不同pH倍半稀釋對沙門氏菌的抑菌活性Fig.10 Inhibition loss of S.enteritis 54001 due to concentration

從不同pH的倍半稀釋結(jié)果可以看出，不同pH植物乳桿菌ST-Ⅲ的CFS倍半稀釋液對兩株指示菌的抑菌作用變化趨勢一致。在低pH，即1/2濃度，甚至有些1/4濃度的抑菌效果都較顯著，1/8濃度時，抑菌效果不顯著。對于高pH，其原樣本身的抑菌率就不高，濃度稀釋后抑菌效果更不顯著，甚至接近于0。綜上，乳酸菌素對指示菌的抑制作用不能低于某一濃度，否則即使在酸性條件下，抑菌作用也不顯著。

2.5 植物乳桿菌ST-Ⅲ對兩株指示菌的殺菌性研究

綜合抑菌性實驗的結(jié)果可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的CFS對金黃色葡萄球菌10384及沙門氏菌54001的抑菌作用顯著，尤其是對沙門氏菌54001，然而其抑菌作用是抑制指示菌的生長還是能殺滅指示菌仍不得而知，于是運用平板計數(shù)法對ST-ⅢCFS的殺菌性進行初步研究。并且運用營養(yǎng)肉湯作為懸浮液研究CFS對指示菌生長過程中的殺菌性。金黃色葡萄球菌10384及腸炎沙門氏菌54001在生理鹽水懸浮液中及在營養(yǎng)肉湯生長過程中的存活率分別見圖11及12。

圖11 金黃色葡萄球菌10384的存活率Fig.11 Survival rate of S.aureus 10384

圖12 腸炎沙門氏菌54001的存活率Fig.12 Survival rate of S.enteritis 54001

由圖11可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的CFS無論是在生理鹽水還是在營養(yǎng)肉湯中，都對金黃色葡萄球菌10384有一定的殺菌作用。在生理鹽水中的殺菌作用強于營養(yǎng)肉湯中。這是由于營養(yǎng)肉湯存在的情況下，金黃色葡萄球菌仍然具有生長繁殖所需的營養(yǎng)。隨著作用時間的延長，金黃色葡萄球菌10384在生理鹽水中的存活率下降，而在營養(yǎng)肉湯中的存活率提高，這可能是由于其生長速率大于其死亡速率。

圖12可知，腸炎沙門氏菌54001在生理鹽水及營養(yǎng)肉湯中的存活率趨勢與金黃色葡萄球菌10384一致。但其在生理鹽水及在營養(yǎng)肉湯生長過程中的存活率均高于金黃色葡萄球菌，可見，植物乳桿菌ST-Ⅲ的CFS對腸炎沙門氏菌54001的殺菌效率低于對金黃色葡萄球菌10384的殺菌效率。這與上述實驗結(jié)果顯示的植物乳桿菌ST-Ⅲ的CFS對金黃色葡萄球菌10384的抑菌作用略高于腸炎沙門氏菌54001一致。

3 結(jié)論

上述實驗結(jié)果表明，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌10384及腸炎沙門氏菌54001均有不同程度的抑制作用，隨著作用時間的延長，抑菌率呈上升趨勢，8 h時抑菌效果最好，且對金黃色葡萄球菌10384的抑菌作用高于腸炎沙門氏菌54001。通過采用過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K處理，與空白MRS對比抑菌活性，排除了產(chǎn)物中過氧化氫的抑菌作用，并證實抑菌成分中含有蛋白類產(chǎn)物。通過采用乳酸等有機酸將空白MRS調(diào)pH至發(fā)酵產(chǎn)物相同，排除了有機酸對兩株指示菌的抑菌作用，進一步證實該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為細菌素。植物乳桿菌ST-Ⅲ所產(chǎn)乳酸菌素在酸性或弱酸性條件下穩(wěn)定，并能保持較高的抑菌活性，隨著pH的上升，抑菌率呈下降趨勢，pH為7時，幾乎無抑菌活性。植物乳桿菌ST-Ⅲ所產(chǎn)乳酸菌素對兩株指示菌的抑菌作用呈現(xiàn)一定的濃度要求，1/4濃度時效果仍顯著，但1/8濃度時，抑菌效果已不明顯。金黃色葡萄球菌10384及腸炎沙門氏菌54001分別是革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌兩個代表菌株，而植物乳桿菌ST-Ⅲ對兩者均有顯著的抑菌作用?？梢姡参锶闂U菌ST-Ⅲ所產(chǎn)乳酸菌素是一類具有廣譜作用的細菌素。植物乳桿菌ST-ⅢCFS殺菌作用的初步研究表明，其對金黃色葡萄球菌10384及腸炎沙門氏菌54001均有一定的殺菌作用，但不是很強烈。目前，作為新資源菌株植物乳桿菌ST-Ⅲ已批準可在食品中應用，若能在應用該菌株加工食品的過程中，綜合考慮該菌株的抑菌特性，不僅能增加相關食品的保藏特性，也有助于改善傳統(tǒng)物理殺菌方法的強度，更好的保持食品營養(yǎng)價值。盡管植物乳桿菌ST-Ⅲ所產(chǎn)乳酸菌素的抑菌作用已初步探明，將其該項特性應用于食品加工，仍有很多工作需要研究。熱加工作為食品加工最常用的方法，該菌株產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性仍需深入探討。而起到抑菌作用的細菌素，其主要物理、化學特性、結(jié)構等仍需進一步通過分離純化來進行深入研究，這些工作將在今后的研究過程中進行。

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[1]Lasagno M,Beoletto V,Sesma F,et al.Selection of bacteriocin producer strains of lactic acid bacteria from a dairy enviroment[J].Microbiologia,2002,25:37-44

[2]Matilla-Sandholm T,M M?tt? J,Saarela M.LAB with health claiminteractions and interference withgastrointestinal flora[J].Int Dairy J,1999,9:25-35

[3]Ennahar S,Sashihara T,Sonomoto K,et al.Class IIa bacteriocins:biosynthesis,structure and activity[J].FEMS Microbiol Rev,2000,24:85-106

[4]Conventry M J,Gordon J B,Wilcock A,et al.Detection of bacteriocin of LAB isolated from food and comparison with pediocin and nisin[J].J Appl Microbiol,1997,83:248-258

[5]Garneau S,Martin N I,Vederas J C.Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria[J].Biochimie,2002,84:577-592

[6]McAuliffe O,Ross R P,Hill C.Lantibiotics:structure,biosynthesis and mode of action[J].FEMS Microbiol Rev,2001,25:285-308

[7]Conventry MJ,Gordon JB,Wilcock A,et al.Detection of bacteriocin of LAB isolated from food and comparison with pediocin and nisin[J].J Appl Microbiol,1997,83:248-258

[8]張艾青,劉書亮,敖靈.產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J].微生物學通報,2007,34(4):753-756

[9]常峰,易奎星,劉小蘭,等.類細菌素高產(chǎn)菌CFl0的篩選誘變及發(fā)酵條件的研究[J].食品科學,2006,27(1):143-147

[10]吳惠芬,毛勝勇,姚文,等.豬源乳酸菌產(chǎn)乳酸及其抑菌特性研究[J].微生物學通報,2005,32(1):79-84

[11]李悅,孫玉梅,楊紅,等.產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及其發(fā)酵特性[J].大連工業(yè)大學學報,2008(1):19-21