郭飛燕，王友志，王曉青，姚亮，紀(jì)明慧，謝樂瓊

（海南師范大學(xué)“省部共建-熱帶藥用植物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571158）

胡椒（Piper nigrum）為胡椒科胡椒屬植物[1]，是海南的特產(chǎn)之一，海南白胡椒因其質(zhì)優(yōu)、味辣在國際市場享有較高的聲譽(yù)。胡椒堿是胡椒中具有許多藥理活性的主要化學(xué)物質(zhì)，目前，已發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促進(jìn)藥物代謝等作用[1-3]，胡椒中胡椒堿的含量因品種、產(chǎn)地，栽培環(huán)境的不同而存在差異，因此其含量是胡椒品質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)。

目前，已報(bào)道的胡椒堿的提取方法和含量測定很多[4-7]，但未見用HPLC法測定海南不同地區(qū)產(chǎn)胡椒中胡椒堿的文獻(xiàn)報(bào)道。本工作擬利用索氏提取法分別對(duì)海南不同地區(qū)產(chǎn)的胡椒果實(shí)及胡椒根和胡椒葉中胡椒堿進(jìn)行提取，并采用HPLC對(duì)胡椒堿的含量進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗(yàn)用的成熟胡椒果實(shí)產(chǎn)于海南臨高、萬寧、陵水、瓊山、文昌、保亭、東方7個(gè)地方。樣品烘干粉碎，密封保存，備用。

胡椒堿對(duì)照品：瑞士，F(xiàn)luka Chemie AG，CH-9470 Buchs，GR，分子量：285.34。甲醇：色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、苯等均為分析純。

高效液相色譜儀（ΜV230+、P230）：大連依利特分析儀器有限公司；EC2000工作站：大連依利特分析儀器有限公司；KQ2200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZG-6050真空干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜檢測條件

選擇色譜柱為大連依利特、250 mm×4.6 mm，5 μL；KromasiL），檢測波長 343.0 nm，以甲醇－水（77∶23）為流動(dòng)相，流動(dòng)速度1.0 mL/min；柱溫為室溫[4-6]。

1.2.2 供試液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品0.030 0 g，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL胡椒堿乙醇溶液，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，待用。

1.2.2.2 供試品溶液

精密稱取胡椒干粉0.100 0 g，置250 mL的平底燒瓶中，加入100 mL 80%乙醇，索氏提取48 h。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，待用。

1.2.3 色譜峰的建立

參照文獻(xiàn)[6]方法分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。進(jìn)樣前先用0.45 μm的濾膜過濾。

1.2.4 對(duì)海南不同地區(qū)產(chǎn)胡椒中胡椒堿的提取

分別精確稱取臨高、萬寧、陵水、瓊山、文昌、保亭、東方7個(gè)不同地區(qū)產(chǎn)的胡椒果實(shí)干粉0.100 0 g，用紗布包裹，于索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL加熱回流提取，用毛細(xì)管取回流液點(diǎn)于玻璃硅膠板上，晾干，置于 V（苯）∶V（乙酸乙酯）∶V（丙酮）=7∶2 ∶1（mL/mL）的展開劑中，取出晾干，在365 nm紫外分析儀下檢測至無紫蘭色斑點(diǎn)[4]，即無胡椒堿檢出為止，提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。

1.2.5 對(duì)海南萬寧地區(qū)胡椒不同部位胡椒堿的提取

分別精確稱取萬寧胡椒的果實(shí)、根、葉各0.100 0g，用紗布包裹，置索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL，加熱回流至胡椒堿提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進(jìn)高相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 空白試驗(yàn)

取無水乙醇空白溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果溶劑出峰少，對(duì)圖譜及含量檢測基本無干擾。

2.1.2 色譜峰的建立

以甲醇－水（77∶23）為流動(dòng)相，檢測波長343.0 nm，流動(dòng)速度1.0 mL/min；柱溫為室溫。參照文獻(xiàn)[4-5]方法分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1、圖2。

圖1 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.1 Piperine standard HPLC diagram

圖2 胡椒供試品HPLC圖Fig.2 HPLC of Piperine samples

2.1.3 線性關(guān)系

精密稱取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別取 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 于 10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以總峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)及回歸方程。胡椒堿在0.020 mg/mL～0.080 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=306 319.892 86+1.454 55×108x，r=0.999 7。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品0.030 0 g，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。取20 μL溶液注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.00%、相對(duì)峰面積值的RSD小于5.00%，表明精密度良好。胡椒堿的含量測定的總峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%，符合含量測定要求。

2.1.5 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于 0、2、4、8、24 h 各取 20 μL 供試品溶液進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果表明：各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.50%、相對(duì)峰面積值的RSD小于5.00%，表明溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。胡椒堿的含量測定的總峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%，符合含量測定要求。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

配制同一批供試品溶液6份，各取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明：各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.00%、相對(duì)峰面積值的RSD小于5.00%，表明重現(xiàn)性良好。胡椒堿的含量測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%，符合含量測定要求。

2.2 海南胡椒中胡椒堿的提取

2.2.1 胡椒堿的含量測定

取樣品溶液的峰面積、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積等數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算。

樣品濃度（%）=（W對(duì)×對(duì)照品含量×（1-對(duì)照品水分）×A樣×樣品稀釋倍數(shù)）/（A對(duì)×對(duì)照品稀釋倍數(shù)）

式中：W對(duì)為對(duì)照品質(zhì)量，g；A樣為樣品溶液峰面積，A對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積。

2.2.2 海南不同地區(qū)胡椒中胡椒堿含量測定

分別精確稱取不同地區(qū)產(chǎn)成熟胡椒果實(shí)干粉0.100 0 g，用紗布包裹，于索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL，加熱回流提取至胡椒堿提取完全，所得提取液用HPLC進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地胡椒中胡椒堿的含量測定結(jié)果Table 1 The determine results of Piperine from different regions of Piper nigrum L.

從表1可以看出，不同地區(qū)產(chǎn)胡椒中胡椒堿含量不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，東南地區(qū)種植的胡椒中胡椒堿含量要比中西部地區(qū)種植的胡椒中胡椒堿含量高，海南萬寧地區(qū)產(chǎn)的胡椒中胡椒堿含量高達(dá)3.17%。其次為海南陵水產(chǎn)胡椒，其中胡椒堿含量高達(dá)2.93%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道胡椒只能生長在年降水量2 500 mm的熱帶地區(qū)，生長期中還需要一段干熱的間隔期[8]。土壤、氣溫、濕度等因素會(huì)影響胡椒的生長和其中總生堿的含量，海南東南部地區(qū)較適合胡椒的種植。

2.2.3 海南胡椒不同部位胡椒堿的提取

分別精確稱取萬寧胡椒的果實(shí)、根、葉各0.100 0 g，用紗布包裹，置索氏提取器中，加入80%無水乙醇100mL，加熱回流至胡椒堿提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進(jìn)高相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。

表2 胡椒不同部位胡椒堿的含量Table 2 Piperine content in different parts of the Piper nigrum L.

從表2可知，在萬寧產(chǎn)的胡椒中，果實(shí)、根、葉中胡椒堿的含量分別為3.17%、0.43%、0.01%，根部的胡椒堿的含量比葉中的高，而果實(shí)中的胡椒堿含量比根和葉中要高得多。

3 結(jié)論

以80%乙醇為溶劑，采用索氏提取法分別從海南不同地區(qū)產(chǎn)的胡椒果實(shí)及胡椒根和胡椒葉中提取胡椒堿，并以HPLC法測定提取液中胡椒堿含量。結(jié)果表明，萬寧、陵水地區(qū)產(chǎn)的胡椒中胡椒堿含量比較高，分別可達(dá)3.17%和2.93%；海南萬寧地區(qū)種植的胡椒中根部和葉中胡椒堿的含量都很低。產(chǎn)地，栽培環(huán)境對(duì)胡椒的生長會(huì)有一定的影響，會(huì)造成其中生物堿的含量的差異。

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