周亞迪，李誠(chéng)，葉瑞雪

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

熱變性法提取鴨血SOD的響應(yīng)面優(yōu)化

周亞迪，李誠(chéng)*，葉瑞雪

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

摘 要：以新鮮鴨血為原料，研究鴨血超氧化物歧化酶（SOD）在熱變性環(huán)境下的提取工藝。通過單因素試驗(yàn)確定了熱變性溫度、熱變性時(shí)間、硫酸鋅濃度3個(gè)因素的取值范圍，并根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理及響應(yīng)面分析得出最優(yōu)提取條件。結(jié)果表明：熱變性溫度55.3℃，熱變性時(shí)間12 min，硫酸鋅的質(zhì)量濃度3.9%，硫酸銅的質(zhì)量濃度1%，SOD比活為1 224.37 U/mg。

關(guān)鍵詞：鴨血；超氧化物歧化酶；熱變性；響應(yīng)面法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是人體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的有效物質(zhì)，因其具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等保健效果，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用到生物化學(xué)、酶學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等諸多學(xué)科[1-3]。國(guó)內(nèi)外有不少單位將SOD作為天然抗氧化劑加到面包、糕點(diǎn)、方便面及罐頭食品中，作為防腐劑收到了很好的效果。并有實(shí)驗(yàn)證明，SOD能夠口服吸收，并能在體內(nèi)保持良好的活性，因此SOD在食品行業(yè)的運(yùn)用具有良好的開發(fā)前景。

SOD的主要來源是動(dòng)物血和肝臟，動(dòng)物血中SOD不僅含量豐富，且提取方便成本低，紅細(xì)胞膜易破[4]，我國(guó)每年來自畜禽的血源有2 300萬(wàn)t，而很久以來我國(guó)對(duì)血液有足夠的認(rèn)識(shí)，但沒有充分的利用[5]。一方面給予血液很高的評(píng)價(jià)，認(rèn)為血液具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健作用，是一種很好的蛋白質(zhì)資源[6]。而另一方面，由于受諸多因素的限制，目前利用率不到1%[7]，致使大量寶貴的畜禽血液資源浪費(fèi)，并造成環(huán)境污染。目前對(duì)豬血、羊血、牛血等畜血中SOD有部分研究[8-10]，提取工藝也相對(duì)較成熟，而對(duì)于禽血研究相對(duì)較少。2009年我國(guó)鴨的存欄量、出欄量均居世界首位[11]。因此，充分利用鴨血生產(chǎn)SOD大有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前提取SOD的主要方法有鹽析法、溶脹法、有機(jī)溶劑法、酶法等，工藝較復(fù)雜，所用溶劑易污染環(huán)境，且成本較高。而熱變性法是利用血細(xì)胞中SOD和血紅蛋白的變性溫度不同來分離除去雜蛋白，達(dá)到提取出SOD的目的。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，環(huán)保，但是同樣存在很多不足[12-13]。有研究表明，在熱變性法提取SOD工藝中，硫酸鹽比氯鹽對(duì)SOD的保護(hù)效應(yīng)好，銅鋅鹽互配比單一的銅鹽或鋅鹽對(duì)SOD的保護(hù)效應(yīng)好[14]。本實(shí)驗(yàn)以熱變性法為基礎(chǔ)，重點(diǎn)研究SOD在提取過程中各影響因素（銅鋅鹽互配濃度、熱變性溫度、熱變性時(shí)間）對(duì)SOD活性的影響，并利用響應(yīng)面分析的方法來求出最佳工藝條件，為制備高活性的SOD提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨血采自四川省雅安市創(chuàng)業(yè)商城市場(chǎng)；檸檬酸三鈉、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸銅等均為分析純，考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白。

1.2 儀器與設(shè)備

BR4i型多功能冷凍離心機(jī)：美國(guó)THERMO公司；Mill-Q型超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；Scientz-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-3200掃描型紫外可見分光光度計(jì)、V-1200型可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；BT 12S電子天平、pHS-3C精密pH計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶血液的制備

新鮮鴨血以3.8%檸檬酸三鈉抗凝，4℃條件下5 000 r/min離心15 min除去黃色血漿，收集紅血球，4℃條件下用生理鹽水洗滌紅血球，5 000 r/min離心10 min，洗滌3次，量取血球體積，加入等體積超純水得到溶血液，0℃～4℃條件下用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎血細(xì)胞（200 W/10 min），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熱變性提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

以新鮮鴨血為原料，考察提取SOD的工藝參數(shù)，重點(diǎn)考察熱變性溫度，熱變性時(shí)間，硫酸鹽濃度對(duì)SOD活性的影響。

1.3.3 提取工藝條件的響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以SOD比活力為響應(yīng)值，利用Design-Expert7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析優(yōu)化提取條件。

1.3.4 SOD活性的測(cè)定

鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定法[15]。

1.3.5 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)比色法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液配成不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，在595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光吸收值，以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 1x+0.0013，R2=0.996 8。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 熱變性溫度對(duì)酶活性的影響

選取 45、50、55、60、65 ℃ 5 個(gè)溫度考察熱變性溫度對(duì)酶活性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 熱變性溫度對(duì)酶活性的影響Fig.1 The effect of heating denaturation temperature on activity of SOD

由圖1可知，鴨血中SOD的酶比活在熱變性溫度45℃～60℃呈緩慢上升趨勢(shì)，65℃時(shí)較60℃時(shí)的酶比活稍低，65℃～70℃時(shí)的酶比活完全呈急劇下降趨勢(shì)，說明高于65℃的熱變性溫度對(duì)SOD的活性有直接負(fù)面的影響，因此最佳熱變性溫度范圍選擇為55℃～65℃，最佳熱變性溫度是60℃。

2.2.2 熱變性時(shí)間對(duì)酶活性的影響

選取 10、15、20、25、30 min 5 個(gè)時(shí)間考察熱變性時(shí)間對(duì)酶活性的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 熱變性時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.2 The effect of heating denaturation time on activity of SOD

由圖2可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性處于上升趨勢(shì)，熱變性時(shí)間在15 min時(shí)，鴨血中SOD的活性達(dá)到最高，之后呈下降趨勢(shì)，在熱變性溫度在20 min以后，酶活性趨于穩(wěn)定，說明熱變性時(shí)間在20 min以后，對(duì)SOD活性的影響較小，因此熱變性的最佳時(shí)間范圍是10 min～20 min，最佳熱變性時(shí)間是15 min。

2.2.3 硫酸鋅濃度對(duì)酶活性的影響

在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)硫酸銅濃度一定時(shí)，硫酸鋅的質(zhì)量濃度在1%時(shí)，鴨血中SOD的酶比活達(dá)到最高值，隨著硫酸鋅的濃度逐漸升高，SOD的活性反而降低，說明低濃度的硫酸鋅對(duì)SOD具有保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在質(zhì)量濃度為1%硫酸鋅濃度下，硫酸銅濃度在1%～8%變化范圍內(nèi)對(duì)酶活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同硫酸鋅質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響Fig.3 The effect of concentration of zinc sulfate quality on activity of SOD

由圖3可知，硫酸鋅濃度在1%時(shí)，隨著硫酸銅的質(zhì)量濃度逐漸增加，鴨血中SOD的活性在逐漸升高，在4%時(shí)達(dá)到最大值，隨后急劇下降，SOD的活性在硫酸銅濃度在5%～8%的范圍時(shí)趨于平穩(wěn)狀態(tài)，說明，硫酸銅的濃度增加到5%后對(duì)SOD的活性影響減小，因此最佳提取鴨血中SOD硫酸銅濃度為4%。

2.3 提取工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以熱變性溫度，熱變性時(shí)間，硫酸銅濃度為自變量，分別由A、B、C表示，以酶比活為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert7.1.6數(shù)據(jù)分析軟件優(yōu)化提取條件。試驗(yàn)因素水平編碼見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2.3.2 回歸模型建立及方差分析

回歸模型建立及方差分析見表3。

經(jīng)Design-expert7.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，建立響應(yīng)面回歸模型，得到以酶比活為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Box-Benhnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

從表3可以看出，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，因此酶比活回歸方程（模型）的回歸效果極顯著，其中，C、A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響顯著。此時(shí)從回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果（回歸系數(shù)R2=0.924 7＞0.9）還可以看出方程的失擬項(xiàng)較小，說明該回歸方程對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合情況較好，各自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)SOD活性影響的大小依次為熱變性時(shí)間＞硫酸鋅濃度＞熱變性溫度。

圖4 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析

在本實(shí)驗(yàn)中，每一個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析，另外一個(gè)因素被固定在零水平[17]，利用Design-Expert7.1.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合[18]，各因素之間的交互作用見圖4。

圖4直觀地反映了各因素對(duì)酶活性的影響。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩交互作用不顯著，橢圓形表示兩交互作用顯著[19]，從三維響應(yīng)面圖可以看出每個(gè)響應(yīng)面都具有各自的較優(yōu)區(qū)域[20]。比較圖4中的等高線圖，各等高線都呈現(xiàn)橢圓狀態(tài)，且硫酸鋅濃度與熱變性溫度的交互作用相對(duì)較顯著。各響應(yīng)面圖中，熱變性時(shí)間對(duì)酶活性的影響較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。

由Design-Expert7.1.6軟件分析得到的最大響應(yīng)值時(shí)對(duì)應(yīng)的編碼值分別為A=-0.108，B=0.057，C=-0.397，與之相應(yīng)的熱變法提取鴨血SOD工藝最佳條件為硫酸鋅濃度3.89%、熱變性溫度55.28℃、熱變性時(shí)間11.98 min，理論最佳提取條件下的酶比活為1 243.25 U/mg。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證此方法的可靠性，采用所得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為硫酸鋅濃度3.9%，硫酸銅濃度1%、熱變性溫度55.3℃、熱變性時(shí)間12 min條件下，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值，酶比活為1 224.37 U/mg?？芍A(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析確定了熱變性法提取鴨血中SOD的最佳工藝條件，即硫酸鋅濃度3.9%，硫酸銅濃度1%、熱變性溫度55.3℃、熱變性時(shí)間12 min，SOD活性達(dá)1 224.37 U/mg。各因素對(duì)SOD活性影響的大小排序?yàn)椋簾嶙冃詴r(shí)間＞硫酸鋅濃度＞熱變性溫度。本實(shí)驗(yàn)為鴨血中SOD的熱變性法提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，與傳統(tǒng)提取工藝相比提高了SOD活性[21]，為進(jìn)一步保持高活性分離純化鴨血SOD提供了科學(xué)參考。

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Optimizing Heating Denaturation Extraction of SOD from Duck Blood by Response Surface Methodology

ZHOU Ya-di，LI Cheng*，YE Rui-xue
（College of Food Science ，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China）

Abstract：With fresh duck blood as raw materials，study of superoxide dismutase （SOD） from duck blood in thermal denaturation conditions extraction process.hrough single factor experiment to determine the thermal denaturation temperature，heating time，the zinc sulfate concentration by a factor of three range，and according to a central composite design principle and response surface analysis the optimum extraction conditions.The results show that： the thermal denaturation temperature at 55.3 ℃， heating time 12 min，the concentration of 3.9%zinc sulfate，copper sulfate concentration of 1%，SOD specific activity of 1 224.37 U/mg.

Key words：duck blood；superoxide dismutase（SOD）；heating denaturation method；response surface method（RSM）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.005

2010年教育部國(guó)家級(jí)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)（101062625）

周亞迪（1990—），女（漢），在讀本科，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工工程。

李誠(chéng)（1964—），男，教授，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。

2012-12-23