高 秋，楊 松，趙祥海，季燕妮，周 維

(宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興 214200)

近年來一氧化氮(NO)和氧化應(yīng)激在胃黏膜病變過程中的作用日益受到關(guān)注［1，2］?？ňS地洛屬于第三代β受體阻斷藥，具有α和β受體阻斷、抗細(xì)胞增殖及細(xì)胞保護(hù)等作用［3］;此外，其對(duì)心肌缺血、腎缺血引起器官損傷的保護(hù)作用逐漸得到闡明［4，5］，但其對(duì)胃缺血再灌注(GI/R)損傷的作用鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察了卡維地洛對(duì)GI/R損傷大鼠胃黏膜損傷指數(shù)(GMDI)及胃黏膜組織中髓過氧化物氧化酶(MPO)活性、NO含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)的影響，以探討卡維地洛對(duì)大鼠GI/R損傷的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品及試劑 ①動(dòng)物:普通級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220～240 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2003-0003。實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，自由飲水，室溫(23±2)℃。②藥品和試劑:卡維地洛(山東齊魯制藥有限公司);SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒、MPO試劑盒、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、Western blot封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。其他均為AR級(jí)化學(xué)試劑。③實(shí)驗(yàn)儀器:高速勻漿機(jī)(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司);751G-可見紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);IX71光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社);Bio-Rad model 680酶標(biāo)儀及Bio-Rad電泳儀(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及卡維地洛應(yīng)用 將25只SD大鼠隨機(jī)分為5組，各5只?？ňS地洛低、中、高劑量組:分別予卡維地洛30、60、90 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)5 d，末次給藥前24 h禁食，末次給藥后60 min采用Zhang等［6］方法制備GI/R損傷模型，即以動(dòng)脈夾夾閉大鼠腹腔動(dòng)脈30 min后再灌注1 h。模型組:僅夾閉腹腔動(dòng)脈制備GI/R損傷模型;假手術(shù)組:僅開腹90 min，未夾閉腹腔動(dòng)脈。

1.2.2 GMDI測(cè)定 取各組大鼠斷頭處死，剖腹，取出胃后沿大彎處剪開，用冰生理鹽水沖洗，在冰盤上展開，置方格計(jì)數(shù)板(每一方格面積為1 mm2)，以局限于胃腺上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍和出血灶的長(zhǎng)度累計(jì)積分:正常為0分，損傷長(zhǎng)度≤1 mm計(jì)1分、≤2 mm計(jì)2分，其余類推;損傷寬度超過1 mm時(shí)加倍計(jì)分，取各組計(jì)分平均值作為GMDI。

1.2.3 胃黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 GMDI測(cè)量完畢后，于冰盤上剪開胃，取1/2胃黏膜置于-80℃保存待用;1/2置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、石蠟包埋，5 μm切片，HE染色。采用雙盲法，在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 胃黏膜SOD、MPO活性及NO、MDA含量的檢測(cè) 取胃黏膜于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進(jìn)行操作，采用比色法檢測(cè)SOD、MPO活性及NO、MDA含量。

1.2.5 胃黏膜Caspase-3蛋白的檢測(cè) 采用Western blot法。取100 μg細(xì)胞總蛋白置于10%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉;將膜置于一抗中4℃ 搖床過夜，置于二抗液內(nèi)室溫下孵育1 h;TBS洗膜3次，置BCIP/NBT顯色液顯色;掃描蛋白印跡顯影圖，利用Image J軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用One-way ANOVA分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠GMDI 卡維地洛低、中、高劑量組GMDI分別為90.4 ±10.4、64.7 ±14.6、52.1 ±9.6，模型組和假手術(shù)組 GMDI分別為 136.1±19.5、2.1±0.9。與假手術(shù)組相比，余四組 GMDI均顯著升高，P均＜0.01;卡維地洛低、中、高劑量組GMDI均顯著高于模型組，P 分別 ＜0.05、0.01 及0.01。

2.2 各組胃黏膜組織形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組胃黏膜未發(fā)現(xiàn)病理學(xué)變化;模型組胃黏膜有糜爛、出血，局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂，間隙擴(kuò)大，并有局部細(xì)胞脫落及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);卡維地洛高劑量組胃黏膜上皮基本完整、連續(xù)，腺體排列較整齊，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且胃黏膜充血較輕微。

2.3 各組胃黏膜組織中 SOD、MPO活性及MDA、NO含量 與假手術(shù)組相比，模型組MDA、NO含量均明顯升高，SOD活性顯著降低、MPO活性顯著升高;與模型組比較，卡維地洛低、中、高劑量組胃黏膜組織中的MDA、NO含量均顯著減少，SOD活性明顯增加、MPO活性顯著降低。詳見表1。

表1 各組胃黏膜組織中SOD、MPO活性及MDA、NO含量比較()

表1 各組胃黏膜組織中SOD、MPO活性及MDA、NO含量比較()

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，ΔP ＜0.01

*卡維地洛低劑量組 122.31 ±279.12 5.35 ±1.09# 4.72 ±1.20# 3.31 ±1.23#卡維地洛中劑量組 145.20± 28.67# 4.86±1.41Δ 3.78±1.14Δ 2.93±0.65#卡維地洛高劑量組 152.53± 25.36Δ 4.43±0.97Δ 2.95±1.47Δ 2.21±0.62#假手術(shù)組168.30 ± 32.47 3.47 ±1.17 2.41 ±0.97 2.73 ±0.57

2.4 各組胃黏膜組織中Caspase-3蛋白表達(dá) 卡維地洛低、中、高劑量組胃黏膜組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)量分別為0.42 ±0.06、0.37 ±0.04、0.26 ±0.03，模型組和假手術(shù)組分別為0.63 ±0.15、0.19 ±0.02。與假手術(shù)組比較，模型組胃黏膜組織中Caspase-3表達(dá)明顯升高，P＜0.01;與模型組比較，卡維地洛高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。

3 討論

GI/R損傷是各種術(shù)后并發(fā)癥的重要誘因，嚴(yán)重威脅人類的健康。GI/R可導(dǎo)致大量氧自由基生成，使胃黏膜組織脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而激活組織細(xì)胞凋亡壞死，引起胃黏膜損傷［7］。本研究顯示，模型組及卡維地洛各組GMDI均顯著高于假手術(shù)組，且胃黏膜有糜爛、出血、局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)。提示模型組及卡維地洛各組存在GI/R損傷。NO為重要的胃黏膜保護(hù)因子，文獻(xiàn)報(bào)道其胃黏膜保護(hù)活作用與增加胃黏膜血流量有關(guān)［8］。但近年研究［1］顯示，GI/R 條件下，胃黏膜組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性增高，造成NO水平急劇增高，過度生成的NO可直接引起細(xì)胞毒作用或通過自由基氧化生成毒性更大的強(qiáng)氧化劑，導(dǎo)致能量代謝障礙使細(xì)胞死亡?？ňS地洛在治療劑量范圍內(nèi)，兼有α1和非選擇性β受體阻滯作用，其對(duì)心肌、腎缺血所致器官損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道。本研究顯示，大鼠GI/R損傷后胃黏膜組織中NO含量及MPO活性均顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［1］;卡維地洛各組NO含量及MPO活性均顯著低于模型組。提示卡維地洛可抑制大鼠GI/R引起的胃黏膜損傷，且可抑制胃黏膜組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)所致NO的過量生成。

文獻(xiàn)報(bào)道，大量氧自由基可使器官組織的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，促使胃黏膜組織細(xì)胞凋亡［7］，而卡維地洛具有較強(qiáng)的自由基清除作用［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠GI/R損傷后胃黏膜組織中MDA含量顯著增加、SOD活性顯著降低，且卡維地洛各組MDA含量均顯著低于模型組、SOD活性均顯著高于模型組;模型組胃黏膜組織中Caspase-3表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，但明顯低于卡維地洛高劑量組。證實(shí)卡維地洛可通過抑制GI/R損傷胃黏膜組織MDA含量增加及上調(diào)SOD活性發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，并可顯著抑制GI/R損傷胃黏膜組織Caspase-3表達(dá)的上調(diào)。

綜上所述，卡維地洛可減輕大鼠GI/R所致胃黏膜損傷，其機(jī)制與減少胃黏膜組織NO過量生成、抑制氧化應(yīng)激、減輕胃黏膜組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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