高子涵，張衛(wèi)兵，* ，梁 琪，楊 敏，張 炎，高維東，李曉鵬，劉興龍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070)

牦牛是青藏高原特有的優(yōu)勢畜種，具有極強(qiáng)的抗逆性、抗病性、耐受性和適應(yīng)性。全世界現(xiàn)有牦牛約1500萬頭，中國是牦牛的主產(chǎn)國，占世界總數(shù)的92%左右，主要分布于西藏、四川、青海、甘肅、新疆等省區(qū)［1－2］。目前，對于牦牛肉、乳的利用較為充分，而牦牛血液由于腥味較重、適口性差，因而利用率不高。牦牛血液中血紅蛋白(Hb)含量很高，達(dá)到(86.41±13.07)g/L，全血鐵的含量為(28.95±4.37)mmol/L，高于豬血液中的含量［3］，因而牦牛血是制取血紅素類產(chǎn)品的天然優(yōu)質(zhì)資源，加以利用后能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益［4－5］。血紅素(heme)是血紅蛋白分子的輔基，在干燥的固體狀態(tài)下較穩(wěn)定，但在光照或有氧化劑存在下極不穩(wěn)定，會很快被氧化［6－7］。當(dāng)血紅素與珠蛋白脫離后亞鐵自動氧化成三價(jià)鐵，所以從動物血液中得到的血紅素產(chǎn)品一般是氯化高鐵血紅素(簡稱氯化血紅素，Hemin)。氯化血紅素是吸收率最高的生物態(tài)鐵劑，具有無體內(nèi)鐵蓄積中毒、不受膳食因素的影響、不會產(chǎn)生消化道刺激癥狀等特點(diǎn)，已經(jīng)成為比較理想的抗貧血藥［8－9］，并且其藥理已被臨床證實(shí)。美國FDA 于1983年7月正式批準(zhǔn)氯化血紅素作為藥品使用。同時(shí)，氯化血紅素在醫(yī)藥行業(yè)中已被廣泛應(yīng)用于血卟啉及其衍生物的制備［10］。目前已有的報(bào)道大多都是以動物血液為原料制備氯化血紅素，其方法主要有酸性丙酮法、羧甲基纖維素法和冰醋酸法等。但由于新鮮血液不易運(yùn)輸和貯藏，以其為原料制備氯化血紅素會使生產(chǎn)成本提高。本實(shí)驗(yàn)旨在研究以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝條件，為牦牛血粉的綜合利用和氯化血紅素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血粉 蘭州天和生物催化技術(shù)有限公司;氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;其他試劑 市售，國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

LabTech紫外可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司;TDD5M低速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司;PHS－3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝 準(zhǔn)確稱取2g牦牛血粉，加入30mL 6mol/L的脲溶液中，超聲處理30min后3000r/min離心10min;向上清液中加入3%酸性丙酮150mL，攪拌抽提30min，再加入3%乙酸鈉11mL攪拌均勻，然后用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，3000r/min離心10min，沉淀用蒸餾水和無水乙醇洗滌后烘干，得到氯化血紅素。

1.2.2 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品中氯化血紅素的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)105℃干燥至恒重，配制成不同濃度的氯化血紅素溶液，在最大吸收波長390nm處測定氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以氯化血紅素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品中氯化血紅素的測定［11］取經(jīng)過105℃干燥至恒重的氯化血紅素樣品，研成粉末;精密稱取適量樣品，置于100mL燒杯中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至刻度，搖勻，過濾。取濾液10mL于100mL容量瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液為空白，在390nm處測定樣品的吸光度。根據(jù)血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中氯化血紅素的質(zhì)量，計(jì)算樣品中血紅素的純度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別選取超聲處理時(shí)間(10、20、30、40、50min)、酸性丙酮加入量(90、120、150、180、210mL)、抽提時(shí)間(10、20、30、40、50min)和乙酸鈉的加入量(2、5、8、11、14mL)4 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測定所得氯化血紅素的質(zhì)量并計(jì)算含量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，超聲處理時(shí)間、酸性丙酮加入量、抽提時(shí)間和乙酸鈉的加入量4個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝參數(shù)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲處理時(shí)間對氯化血紅素得率的影響 在氯化血紅素的制備過程中，分別調(diào)整超聲處理時(shí)間為 10、20、30、40、50min，其他條件與 1.2.1 相同，以考察不同超聲處理時(shí)間對氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲處理時(shí)間對氯化血紅素含量的影響Fig.1 The effect of ultrasonic breaking time on the yield of hemin

由圖1可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長，氯化血紅素的含量先上升后下降。當(dāng)超聲處理時(shí)間從10min增加到30min時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加，當(dāng)超聲處理時(shí)間為30min時(shí)，含量達(dá)到最高，為2.08mg/g。當(dāng)處理時(shí)間超過30min以后，氯化血紅素含量逐漸降低，這是因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間過長時(shí)，釋放出大量的聲波，溫度升高幅度過大，使血粉中的蛋白質(zhì)變性，其中結(jié)合的氯化血紅素難以釋放，從而影響氯化血紅素的產(chǎn)量［11］。

2.1.2 酸性丙酮加入量對氯化血紅素得率的影響在氯化血紅素的制備過程中，分別調(diào)整酸性丙酮加入的量分別為 90、120、150、180、210mL，其他條件與1.2.1相同，以考察不同酸性丙酮加入量對氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酸性丙酮加入量對氯化血紅素含量的影響Fig.2 The effect of the amount of acetone acidified on the yield of hemin

氯化血紅素易溶于酸性丙酮液，這是采用酸性丙酮法制備氯化血紅素的基本原理，酸性丙酮液的加入量對于氯化血紅素從蛋白中的解離影響較大［12］。由圖2可以看出，當(dāng)酸性丙酮加入量由90mL增加到150mL時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加，當(dāng)酸性丙酮加入量為150mL時(shí)，氯化血紅素含量達(dá)到最高(2.11mg/g)。當(dāng)酸性丙酮加入量超過150mL以后，氯化血紅素含量增速減緩，加入量為210mL時(shí)，含量反而降為2.10mg/g。由于生產(chǎn)中要節(jié)約成本，應(yīng)該選擇的酸性丙酮加入量為150mL。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 The variance analysis of orthogonal test

2.1.3 抽提時(shí)間對氯化血紅素得率的影響 在氯化血紅素的制備過程中，分別調(diào)整加入酸性丙酮后抽提時(shí)間為 10、20、30、40、50min，其他條件與 1.2.1 相同，以考察不同抽提時(shí)間對氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 抽提時(shí)間對氯化血紅素含量的影響Fig.3 The effect of the extraction time on the yield of hemin

由圖3可以看出，隨著抽提時(shí)間的延長，氯化血紅素的含量逐漸增加。當(dāng)抽提時(shí)間由10min增加到30min時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加。當(dāng)抽提時(shí)間為30min時(shí)，氯化血紅素的含量最高(2.14mg/g)。而當(dāng)抽提時(shí)間超過30min時(shí)，抽提時(shí)間對氯化血紅素含量的影響逐漸變小，含量增加緩慢，抽提時(shí)間為50min時(shí)，含量僅增加0.01mg/g。由于生產(chǎn)中要盡量縮短生產(chǎn)周期，所以選用的抽提時(shí)間為30min。

2.1.4 乙酸鈉加入量對氯化血紅素得率的影響 乙酸鈉是氯化血紅素提取時(shí)的沉淀劑，可以使溶液中氯化血紅素沉淀下來。在氯化血紅素的制備過程中，分別調(diào)整乙酸鈉的加入量為 2、5、8、11、14mL，其他條件與1.2.1相同，以考察不同乙酸鈉加入量對氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著乙酸鈉加入量的增加，氯化血紅素的含量先增加后降低。當(dāng)乙酸鈉加入量由2mL增加到8mL時(shí)，氯化血紅素的含量增加顯著(p＜0.05)。當(dāng)乙酸鈉加入量為8mL時(shí)，氯化血紅素的含量達(dá)到2.18mg/g。而當(dāng)乙酸鈉加入量大于8mL時(shí)，氯化血紅素含量有所下降。因?yàn)殡S著乙酸鈉加入量的增加，開始會有更多的氯化血紅素沉淀出來，但當(dāng)乙酸鈉的加入過量時(shí)，不溶解的乙酸鈉會混入氯化血紅素，降低產(chǎn)品的純度［13］。由于生產(chǎn)中要盡量節(jié)約成本，所以選用的選用乙酸鈉加入量為8mL。

圖4 乙酸鈉加入量對氯化血紅素含量的影響Fig.4 The effect of the amount of sodium acetate on the yield of hemin

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以氯化血紅素含量為指標(biāo)，4個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可以看出，四個(gè)因素對產(chǎn)量的影響作用由大到小依次為:乙酸鈉加入量＞抽提時(shí)間＞酸性丙酮加入量＞超聲處理時(shí)間。同時(shí)得到制備氯化血紅素的最優(yōu)參數(shù)組合為A2B2C2D3，即超聲處理時(shí)間30min，酸性丙酮加入150mL，抽提時(shí)間30min，乙酸鈉加入量為11mL。同時(shí)，由表3的方差分析結(jié)果可以看出，乙酸鈉加入量對氯化血紅素含量的影響極顯著(p＜0.0001)，抽提時(shí)間對氯化血紅素含量的影響較顯著(p=0.053)，而酸性丙酮加入量和超聲處理時(shí)間對氯化血紅素含量的影響不顯著(p＞0.05)。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于最優(yōu)組合不包含在正交實(shí)驗(yàn)表中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)組合A2B2C2D3對應(yīng)的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果表明，在此條件下，氯化血紅素的含量達(dá)到2.30mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中任何一種組合的含量都高，說明正交實(shí)驗(yàn)確定的工藝參數(shù)是可靠的。因此，實(shí)驗(yàn)最終確定的最佳工藝參數(shù)為超聲處理時(shí)間30min、酸性丙酮加入量150mL、抽提時(shí)間30min、乙酸鈉加入量11mL。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)，對牦牛血粉制備氯化血紅素的4個(gè)因素(超聲波處理時(shí)間、酸性丙酮的添加量、提取的時(shí)間、乙酸鈉的添加量)進(jìn)行初步研究。在此基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，得到的最優(yōu)制備工藝參數(shù)為:超聲處理時(shí)間30min，酸性丙酮加入 150mL，抽提時(shí)間 30min，乙酸鈉加入量為11mL。在此條件下，氯化血紅素的含量為2.30mg/g。

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