汪少華，曹清明 ，余元善，徐玉娟，肖更生，吳繼軍，唐道邦

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州510610)

近些年來，中國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，目前已成為南亞熱帶地區(qū)的最大宗水果。目前香蕉主要以鮮食為主，深加工較少，其主要原因是香蕉在剝皮、切片、打漿榨汁等過程中極易產(chǎn)生組織褐變現(xiàn)象［1］。香蕉加工中的酶促褐變主要是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)引起的［2］。為了抑制香蕉果肉中多酚氧化酶引起的褐變，傳統(tǒng)的方法是通過熱加工或一些化學護色劑(檸檬酸、亞硫酸鹽和抗壞血酸等)來鈍化或抑制香蕉果肉中多酚氧化酶活力。熱加工易使產(chǎn)品產(chǎn)生蒸煮味，并對香蕉中的營養(yǎng)成分破壞較大，而護色工藝本身不能完全鈍化香蕉果肉中的多酚氧化酶，且護色劑的添加容易產(chǎn)生一系列的食品安全問題，對產(chǎn)品的風味也有一定的影響［3－4］。因此，尋找新的加工方法來鈍化香蕉果肉中的多酚氧化酶，并減少對其營養(yǎng)成分的破壞是提高香蕉產(chǎn)品品質(zhì)，實現(xiàn)高附加值的有效途徑。高壓二氧化碳技術是目前發(fā)展較快的一種新型的非熱加工技術，它克服了熱加工造成的種種弊端［5－6］。研究表明，在一定的壓力下(3～30MPa)，二氧化碳對食品中微生物具有殺滅效果，同時能使部分酶鈍化。目前，關于高壓二氧化碳技術對食品中微生物的滅菌效果研究較多，但對食品內(nèi)源酶鈍化作用的研究相對較少。幾項研究表明，高壓二氧化碳技術處理能有效降低多種酶的活性，并認為酶活性的降低與酶二級結構中α－螺旋結構變化有關［7－9］。Ishkawa 等［10］發(fā)現(xiàn)，在25MPa、35℃、30min的超臨界二氧化碳的處理下，脂肪酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及葡萄糖氧化酶的活性分別為處理前的62.9%、31.3%、37.6%、12.4%，同時觀察到處理后α－螺旋結構發(fā)生了變化，可能是這種變化導致了酶活性的變化。目前，評價高壓CO2處理在香蕉果肉鈍酶護色方面的研究還未見報道。本文比較了CO2壓力、溫度和處理時間對香蕉果肉中多酚氧化酶鈍化的影響，并且采用二次回歸正交旋轉組合設計優(yōu)化了高壓二氧化碳對香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化工藝，為高壓CO2處理在香蕉果肉鈍酶護色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉 屬于廣州本地蕉品種，表皮黃色，購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場;99.5%二氧化碳氣體 廣州龍奧氣體設備有限公司;其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

DJ12B－A11打漿機 九陽打漿機;B－25高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠;UV－1800紫外－可見分光光度計 日本島津公司;5702R型高速冷凍離心機 德國eppendorf公司;50MPa－11B高壓二氧化碳處理設備 杭州華黎泵業(yè)有限公司研制。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉果肉的高壓CO2處理方法 將切成長1cm小段的香蕉果肉(約100g)，置于高壓CO2裝置的樣品處理室中。調(diào)節(jié)處理室的溫度和CO2的壓力到設定值(約5～6min)后，恒溫恒壓保持一定的時間，緩慢釋放CO2到正常大氣壓(約5～6min)后，取出樣品用于后續(xù)的多酚氧化酶活力測定實驗。

1.2.2 香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活力測定 取處理后的樣品香蕉果肉(100g)與250mL的0.1mol/L磷酸鈉鹽緩沖液體(pH5.5)混合，同時添加3.5g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)和3.5mLTriton X－100;放置在打漿機中中速處理3min后，轉入500mL燒杯中高速均質(zhì)5min;將上述均質(zhì)后的樣品于4℃下10000×g，離心10min，上清液即是香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶液。多酚氧化酶活力測定采用鄰苯二酚法［11］。具體為:20μL待測樣品酶液、2mL 50mmol/L的磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)和0.5mL 50 mol/L鄰苯二酚水溶液充分混合，反應體系溫度為30℃，立即置于分光光度計中，測定并監(jiān)控OD420值的變化，以每分鐘ΔOD420變化0.001所需的酶量為一個酶活力單位。結果以殘留的多酚氧化酶活表示，多酚氧化酶活殘留率(%)=處理后的酶活力(A)/處理前的酶活力(A0)×100。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同CO2壓力對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉分別在5、10、15、20、25MPa的高壓CO2下處理20min(55℃)后，測定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.3.2 不同溫度對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉分別在30、40、50、55、60℃下經(jīng)20MPa的高壓CO2處理時間20min后，測定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.3.3 不同處理時間對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉在20MPa的高壓CO2處理(55℃)下分別處理 0、20、40、50、60、80min 后，測定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.4 鈍酶條件的優(yōu)化 在單因素實驗基礎上，以降低香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活為指標，采用二次回歸正交旋轉組合設計方法優(yōu)化對高壓CO2處理鈍酶影響最顯著的因素(CO2壓力、溫度、處理時間)，表1列出了各因素的水平編碼表。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 統(tǒng) 計 分 析 軟 件 DX6Trial［12－13］對 數(shù) 據(jù) 進 行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同CO2壓力對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖1可知，在55℃、處理時間為20min的條件下，香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活隨著壓力的增大而快速降低。在15MPa以下時，隨著CO2壓力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化率顯著提高，而在15MPa以上時，隨著CO2壓力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化率并沒有顯著提高(p＞0.05)。

圖1 不同壓力的高壓CO2處理香蕉果肉后其多酚氧化酶活殘留率Fig.1 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various pressure of high pressure carbon dioxide at 55℃for 20 min

2.1.2 不同溫度對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖2可知，隨著溫度的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化速率明顯提高，50℃是高壓CO2鈍化香蕉果肉中多酚氧化酶的關鍵轉折點，當溫度低于50℃，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率一般，但當溫度高于50℃后，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率顯著提高。例如，香蕉果肉在60℃下經(jīng)20MPa的高壓CO2處理時間20min后殘留的酶活力少于10%，而香蕉果肉在30℃同樣的壓力和時間處理下，果肉中的多酚氧化酶幾乎沒有鈍化。

圖2 香蕉果肉經(jīng)不同溫度的高壓CO2(20MPa，20min)處理后其多酚氧化酶活殘留率Fig.2 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various temperature of high pressure carbon dioxide at 20 MPa for 20 min

2.1.3 處理時間對香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖3可知，香蕉果肉55℃經(jīng)20MPa的高壓CO2處理20min后，多酚氧化酶的殘留率急劇下降，為21.5%，若繼續(xù)延長處理時間到80min后，多酚氧化酶的殘留率僅下降到9.8%。所以香蕉果肉中多酚氧化酶在高壓CO2處理20min時，其多酚氧化酶的殘留率下降呈關鍵轉折點，即處理20min之前，隨著處理時間的延長，多酚氧化酶的殘留率呈迅速下降狀態(tài)，為快速鈍化期;當處理20min之后，隨著處理時間的延長，多酚氧化酶殘留率呈緩慢下降狀態(tài)，進入緩慢鈍化期。

圖3 香蕉果肉經(jīng)高壓CO2(20MPa，55℃)處理不同時間后多酚氧化酶活殘留率的變化Fig.3 Change of relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide(20 MPa)for 20 min at 55℃

2.2 鈍酶條件的優(yōu)化

綜合單因素實驗影響結果，選取CO2壓力、溫度和處理時間對高壓CO2處理鈍酶影響最顯著的因素，確定各因素的上、下限，按二次回歸正交旋轉組合設計方法確定因素及水平(表1)。采用二次回歸正交旋轉組合設計將因素水平設計成23個實驗組，實驗結果見表2。

對表2的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到香蕉果肉中多酚氧化酶的殘留率(Y)對溫度(X1)、CO2壓力(X2)、處理時間(X3)的二次多項回歸方程為:Y=0.16－0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.015+0.04+0.022+0.026X1X2+0.013X1X3+0.00675X2X3。

表2 實驗設計及結果Table 2 Experiment Design and Results

對該模型進行方差分析，結果見表3。從方差分析結果來看，模型的顯著性檢驗p＜0.01，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計學意義。模型中 X1、X2、X3、極顯著，顯著，其它項不顯著。對表2的數(shù)據(jù)進行回歸分析，剔除不顯著交互作用，回歸分析得到Y對X1、X2、X3的標準回歸方程為:Y=0.16 －0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.04+0.022。在實驗范圍內(nèi)，對于高壓CO2處理對香蕉果肉中多酚氧化酶的酶活殘留率，一次項系數(shù)估計值的絕對值X1＞X3＞X2，說明溫度對多酚氧化酶的酶活殘留率影響最大，其次是時間，最小是CO2壓力。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

最后，通過DX6Trial軟件的優(yōu)化功能及數(shù)學求偏導，獲得了高壓CO2處理后香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率最小響應值及其所對應的因素條件。他們分別是在19.91MPa的高壓CO2下于59.33℃處理50min，此時香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率為0.81%。考慮到成本問題及各因素對響應值的影響順序，選擇最優(yōu)處理條件為壓力19MPa、溫度60℃和保壓時間50min，在此條件下進行驗證實驗，香蕉果肉的多酚氧化酶活殘留率為0.9%，與理論預測值相近。

3 結論

3.1 在香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶期間，影響香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的因素大小順序依次是處理溫度、處理時間和壓力。

3.2 采用二次回歸正交旋轉組合設計法優(yōu)化了香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶條件，并獲得相關的回歸模型。優(yōu)化后的香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶條件是19MPa的高壓CO2在60℃下處理50min，處理后香蕉果肉的多酚氧化酶活殘留率僅為0.9%。

［1］李玉萍，方佳.中國香蕉產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展對策研究［J］.中國農(nóng)學通報，2008，24(8):443－447.

［2］Mowlah G，Takono K，Kamoii.Browing phenomenon by banana polyphenoloxidases［J］.Journal of Japanese Society of Food Science and Technology，1983，30(4):245－251.

［3］Aurore G，Parfaitb B，F(xiàn)ahrasmane L.Bananas，raw materials for making processed food products［J］.Trends in Food Science ＆Technology，2009，20(2):78－91.

［4］滕建文，吳蘇才，韋保耀.不同品種香蕉對香蕉粉加工的影響［J］.食品工業(yè)科技2007，28(2):88－90.

［5］Zhang J，Thomas A，Davis T A，et al.Sterilization using highpressure carbon dioxide［J］.Journal of supercritical fluids，2006，38(3):354－372.

［6］Garcia－Gonzalez L，Geeraerd A H，Spilimbergo S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods:The past，the present and the future［J］.International journal of food microbiology，2007，117(1):1－28.

［7］Gui F，Wu J，Chen F，et al.Inactivation of polyphenol oxidases in cloudy apple juice exposed to supercritical carbon dioxide［J］.Food Chemistry，2007，100(4):1678－1685.

［8］Pozo－Insfran D，Balaban M O，Talcott S T.Inactivation of polyphenol oxidase in muscadine grape juice by dense phase－CO2processing［J］.Food Research International，2007，40(7):894－899.

［9］Gui F，Chen F，Wu J，et al.Inactivation and structural change of horseradish peroxidase treated with supercritical carbon dioxide［J］.Food chemistry，2006，97(3):490－489.

［10］Ishikawa H，Shimoda M，Yonekura A，et al.Inactivation of Enzymes and Decomposition of α－Helix Structure by Supercritical Carbon Dioxide Microbubble Method［J］.Journal of agricultural and food chemistry，1996，44(9):2646－2649.

［11］Coseteng M Y，Lee C Y.Changes in apple polyphenol oxidase and polyphenol concentrations in relation to degree of browning［J］.Journal of Food Science，1987，52(4):985－989.

［12］Yildiz Zehra.Optimization of the parameters of the magnetic filtration process using response Surface methodology［J］.Transport in Porous Media，2011，90(3):965－975.

［13］袁志發(fā)，周靜芋.實驗設計與分析［M］.北京:高等教育出版社，2000:346－348.